一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究

－　Ｃ　Ｔ　－　－－Ｉｌｌ０ＵＬＴＵＲ｜Ｅ　■●嘲Ｕ—ＩＩ枷Ｃ●　华北农学报・２００６，２１（２）：１０—１　２　一种玉米叶片基因组ＤＮＡ快速提取　新方法的初步研究　雷开荣　，石春焱２，李明顺　，李晓辉　，李新海　（１．重庆市农业科学研究所，重庆市农作物生物工程中心，重庆４０００５５；２．内蒙古通辽市农业科学院，内蒙古通辽１０００８１）　０２８０００　３．中国农业科学院作物科学研究所，农业部作物遗传育种重点开放实验室。北京摘要：在玉米分子标记辅助育种工作中，需要对大量群体的个体样本进行分子标记分析，其中ＤＮＡ的高效快速提　取是关键的技术环节。以异硫氰酸胍为主要提取试剂，结合使用组织研磨器（Ｑｉａｇｅｎ　Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ），建立了一种玉米叶片　基因组ＤＮＡ的快速提取新方法。利用此方法提取玉米叶片基因组ＤＮＡ，具有使用药品少、操作步骤简单、快速、成本　低、ＤＮＡ质量稳定等优点，通常情况下每人每个工作１３可以提取３００个ＤＮＡ样品。此ＤＮＡ提取方法可有效地用于玉　米分子标记分析。　关键词：玉米；ＤＮＡ提取；异硫氰酸胍；分子标记　中图分类号：￥５１３．０１　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—７０９１（２００６）０２—００１０—０３　Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｉｅ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｉｚｅ　ＬＥＩ　Ｋａｉ．ｒｏｎｇ　，ＳＨＩ　Ｃｈｕｎ．ｙａｎ　，ＬＩ　Ｍｉｎｇ—ｓｈｕｎ。ＬＩ　Ｘｉａｏ．ｈｕｉ。ＬＩ　Ｘｉｎ．ｈａｉ。　，，（１．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｃｒｏｐ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００５５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｔｏｎ￣ｉａｏ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｌａ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｎ￣ｉａｏ　０２８０ｏｏ，Ｃｈｉｎａ；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡＡＳ，Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８　１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｋｅｒ　ａｉｄｅｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ　ａｓ　ａ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｎｅｅｄｅｄ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｅ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｍａｉｚｅ　Ｗａｓ　ｅｓｔａｂ—　ｌｉｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍｔｈｉｏｅｙａｎａｔｅ（ＧｕＳＣＮ），ａｎ　ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ　ｒｅａｇｅｎｔ，ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｑｉａｇｅｎ　Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ．　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｌｅｓｓ—ｒｅａｇｅｎｔ　ｕｓｅｄ，ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｔｏ　ｒｕｎ，ｃｏｓｔ—ｓａｖｉｎｇ，ｅｔｃ．Ｔｈｒｅｅ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｘ—　ｔａｅｔｒｅｄ　ｅａｃｈ　ｗｏｒｋｄａｙ　ｂｙ　ｐｅｒ　ｃａｐｉｔａ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｃａｎ　ｂｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｎａａｌｙ—　ｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍａｉｚｅ；ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＧｕＳＣＮ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　随着分子生物学的快速发展，以ＰＣＲ为基础的　多种分子标记技术如ＲＡＰＤ，ＳＳＲ，ＡＦＬＰ等已广泛应　的，但尚存在着操作步骤多、程序复杂、耗时较长、研　磨不均匀、研磨时需要添加液氮等缺点，在分子标记　辅助育种工作中对大样本容量进行分析时，显得尤　为突出。目前，在优质蛋白玉米（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｉｚｅ，ＱＰＭ）分子标记辅助选择中，基于０２基因控制　的玉米高赖氨酸含量的ＳＳＲ分子标记技术已经建　用于玉米遗传多样性、种质资源评价、指纹图谱建　立、性状标记与辅助选择等＿ｌ　Ｊ。在应用分子标记　中，ＤＮＡ的高效、快速提取是基本环节。迄今，已建　立了多种玉米ＤＮＡ提取方法，如ＳＤＳ、ＣＴＡＢ　法＿４。ｊ。这些方法是为适应不同研究目的而建立　立，并在选育工作中开始应用＿８　Ｊ。为了及时完成对　收稿日期：２００５—１２—２５　基金项目：农业部９４８计划（２００３一Ｑ０３—３）；国家自然科学基金（３０３００２２３）；２００５年“西部之光”访问学者计划项目　作者简介：雷开荣（１９６５一），副研究员，主要从事作物遗传改良与生物技术研究；李新海为通讯作者。　维普资讯 http://www.cqvip.com

２期　雷开荣等：一种玉米叶片基因组ＤＮＡ快速提取新方法的初步研究　ｌ１　早期分离群体大量样本的ＳＳＲ分子标记鉴定，及时　准确的进行目标性状的前景选择，建立以叶片为材　料基础的ＤＮＡ快速提取方法是必要的。　本研究以玉米ＱＰＭ群体幼苗至成熟期叶片为　材料，在对多种玉米ＤＮＡ提取方法进行比较的基础　上，建立了以异硫氰酸胍为主要试剂，并结合组织研　磨器（Ｑｉａｇｅｎ　Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ）的ＤＮＡ快速提取方法，并探　讨了将提取的ＤＮＡ用于玉米ＲＡＰＤ和ＳＳＲ分子标　记分析的可行性。　１　材料和方法　１．１供试材料　以玉米ＱＰＭ自交系ＣＡ３３５、普通玉米自交系中　黄２０４及（（中黄２０４×ＣＡ３３５）×中黄２０４）ＢＣ１Ｆ１群　体的幼苗和成熟期叶片为试材，用于ＤＮＡ提取。　１．２　ＤＮＡ提取与检测　ＤＮＡ提取步骤：（１）将叶片剪成１　ｃｍ２大小，每２　ｍＬ圆底离心管中放人２～３片，每管放人３　ｍｌｎ钢珠　２粒，加入５　ｍｏｌ／Ｌ异硫氰酸胍溶液５００　Ｌ；（２）盖紧　离心管盖，将离心管放人支架管孔内；用底盖和上盖　将支架盖住（注意盖子的方向性）；（３）在组织研磨器　（Ｑｉａｇｅｎ　Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ，由德国Ｒｅｔｓｃｈ公司生产）上以３０　Ｈｚ的频率震荡３０～６０　Ｓ，交换支架的方向，再震荡　３０～６０　Ｓ，以保证样品研磨的均匀性。（４）加入４　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１０４（ｐＨ　５．２）７００　ｔｔＬ混匀，室温放置１０　ｍｉｎ。（５）１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，取上清，加入等体　积无水乙醇，沉淀ＤＮＡ。（６）１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清。（７）加１　ｍＬ７０％乙醇，洗涤沉淀。（８）　１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２　ｍｉｎ，弃上清。（９）晾干沉淀或真　空抽干，加５０　Ｌ　ｄｄＨ２０，完全溶解后，一２０￣（３保存备　用。　用ＰＥ　Ｌａｍｂｄａ３５紫外分光光度计测定ＤＮＡ样　品的Ａ２６０／Ａ２８０比值；取４　ｔｔＬ　ＤＮＡ溶液在０．８％琼　脂糖凝胶中进行电泳检测，用ＥＢ染色，Ｂｉｏ．ＲＡＤ凝　胶成像系统拍照。　１．３　ＳＳＲ分子标记检测　ＳＳＲ引物Ｐｈｉ０５７序列摘自Ｍａｉｚｅ　ＤＢ（２００２），由　上海生物工程公司合成。Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄ　Ｎ１＇Ｐ等　购自北京鼎国生物技术有限公司。　‘　ＰＣＲ反应总体积为１０止，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ　）１　Ｌ，ｄ　ＮＴＰ（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１　ｔｔＬ，弓ｆ物　（２０　ｔｔｍｏｌ／Ｌ）０．１３　ｔｔＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（２　Ｕ／￣Ｌ）０．２５　，ＤＮＡ模板２．５　，ｄｄＨ２Ｏ　６．０２　ｔｔＬ。热反应扩增　体系为：９４　ｃＩ＝变性２　ｍｉｎ，６０　ｃＩ＝退火３０　Ｓ，７２　ｏＣ延伸　５０　Ｓ，１个循环；９４　ｏＣ变性５０　Ｓ，６０　ｏＣ退火３０　Ｓ，７２　ｃＩ＝　延伸５０　Ｓ，３５个循环；在７２　ｃＩ＝延伸５　ｍｉｎ。聚丙烯酰　胺凝胶电泳及银染程序参照李晓辉等　Ｊ方法进行。　１．４　ＲＡＰＤ分子标记检测　随机引物ＯＰＣ６由上海生物工程公司合成，　ｄ　ＮＴＰ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶等购自北京鼎国生物技术有　限公司。ＰＣＲ反应总体积为２５　，包括２．５　１０　×Ｂｕｆｆｅｒ，０．５　Ｌ　ｄ　ＮＴＰ，０．５　Ｌ　Ｔａｑ酶，１．５　Ｌ　ＭｇＣ１２，　１　ｔＬＬ　Ｐｒｉｍｅｒ，１　ｔｔＬ　ＤＮＡ（１０　ｎｇ／ｐ．Ｌ），１８　ｐ．Ｌ　ｄｄＨ２０。热　反应扩增条件为：９４　ｃＩ＝预变性３　ｍｉｎ，之后，９４　ｃＩ＝变　性３０　ｓ，３７　ｃＩ＝退火３０　Ｓ，７２℃延伸８０　Ｓ，４０个循环后，　再７２　ｃＩ＝延伸７　ｍｉｎ。扩增产物在１．４％琼脂糖凝胶　中进行电泳检测，ＥＢ染色后，在Ｂｉｏ．ＲＡＤ凝胶成像　系统上进行图像记录并分析。　２　结果与分析　２．１　ＤＮＡ样品的质量检测　用紫外分光光度计分别测定了１０个幼苗期叶　片和成熟期叶片样品的ＤＮＡ纯度。结果表明，幼苗　期叶片ＤＮＡ的Ａ２６０／Ａ２８０比值为（１．８９　４－０．１２），成　熟期叶片ＤＮＡ的Ａ２６０／Ａ２８０比值为（１．９３±０．２０）。　对样品ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现用　该法提取的玉米叶片ＤＮＡ均有清晰一致的主带，没　有发生明显的ＤＮＡ降解现象（图１，２）。由于在提取　过程中没有去除ＲＮＡ，在电泳图中，可以看到明显　的ＲＮＡ带。检测结果表明，用异硫氰酸胍法提取的　玉米叶片基因组ＤＮＡ具有较高的纯度，符合分子标　记分析的要求。　１～８（（中黄２０４×ＣＡ３３５）×中黄２００）ＢＣ１Ｆ．单株　１～８　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｆｒｏｍ　ＢＣ１　ＦＩ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　（（ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ２００×ＣＡ３３５）×ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ２０４）　图１　用异硫氰酸胍法提取成熟期叶片ＤＮＡ电泳图　Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｍａｔｕｒｉｔｙ劬ｅ　维普资讯 http://www.cqvip.com

－　Ｃ　１　－——　ｌｉ８１ｉｌＣＵＬＴＵＲｇＥ　１　２　¨畦ｌｉＬｌ－￥１ＨＩＣｌｌ——　华北农学报　２ｌ卷　ＳＳＲ引物ｐｈｉ０５７对玉米ＱＰＭ回交群体中的个体进　行Ｏ２基因的前景选择，能够清晰地鉴定出纯合显性　Ｏ２Ｏ２和杂合Ｏ２　Ｏ２基因型（图４）。电泳检测结果表　明，用异硫氰酸胍法提取的玉米叶片基因组ＤＮＡ可　以用于ＲＡＰＤ和ＳＳＲ标记分析。　１—１０（（中黄２０４×ＣＡ３３５）×中黄２０４）ＢＣｌＦｌ单株　１～１０　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｆｒｏｍ　ＢＣｌ　Ｆｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　（（ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ２０４×ＣＡ３３５）×ｚｈｏｎｇｈｕ￣ｎｇ２０４）　图２用异硫氰酸胍法提取幼苗期叶片ＤＮＡ电泳图　Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｓｔａｇｅ　Ｍ分子量标准；１　ＣＡ３３５；２，３中黄２０４；　４—８（（中黄２０４×ＣＡ３３５）×中黄２０４）ＢＣ　Ｆ　单株　Ｍ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｉ（１００　ｂｐ）；１　ＣＡ３３５；２．３　Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ　２０４；　４—８　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｆｒｏｍ　ＢＣｌＦｌｏｐｕｌｐａｔｉｏｎ（（ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ　２０４×　ＣＡ３３５）×ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ　２０４）　２．２分子标记分析　分别用ＲＡＰＤ和ＳＳＲ标记分析对异硫氰酸胍法　提取的成熟期叶片ＤＮＡ进行扩增。用随机引物　ＯＰＣ６对ＤＮＡ样品进行扩增，能够得到清晰的ＤＮＡ　谱带，且不同ＤＮＡ样品间存在带型差异（图３）。用　图３用ＲＡＰＤ法检测用异硫氰酸胍法提取的ＤＮＡ质量　Ｆｉｇ．３　Ｑｕａｌｉｔｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＲＡＰＤ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｍ分子量标准；１～５１（（中黄２０４×ＣＡ３３５）×中黄２０４）ＢＣｌＦｌ单株；５２　ＣＡ３３５　Ｍ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔａｎｄａｒｄ；１—５１　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｆｒｏｍ　ＢＣｌＦｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（（ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ２０４×ＣＡ３３５）×ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ２０４）；５２　ＣＡ３３５　图４　用ＳＳＲ－ＰＣＲ法检测用异硫氰酸胍法提取的ＤＮＡ质量　Ｆｉｇ．４　Ｑｕａｌｉｔｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＳＲ　ｍｅｔｈｏｄ　３　讨论　建立快速、经济、可靠的ＤＮＡ提取技术是育种　工作所必须的基本环节。我们在已经建立的基于０２　基因控制的高赖氨酸含量分子标记技术基础上＿８］，　针对ＳＳＲ分子标记技术特点，对目前采用的多种玉　米ＤＮＡ提取方法进行简化及比较研究，认为根据研　究目标可以建立相应的ＤＮＡ提取技术。　本试验中，用异硫氰酸胍法可以从玉米幼苗期　及成熟期叶片中提取符合试验要求的ＤＮＡ，ＤＮＡ样　量分子标记分析的需要，为在分离世代进行目标基　因的前景选择提供了技术基础。　参考文献：　［１］　王斌．植物细胞工程与分子育种技术研究［Ｍ］，北　京：中国农业科学技术出版社，２００３．１６８—１８１．　［２］贾继增．分子标记种质资源鉴定和分子标记育种［Ｊ］．　中国农业科学，１９９６，２９（４）：１—１０．　［３］李晓辉，李新海，李文华，等．ＳＳＲ标记技术在玉米杂　交种纯度鉴定中的应用［Ｊ］．作物学报，２００３，２９（１）：　６３—６８．　［４］　王景雪，孙　毅，高武军．一种简便实用的植物总　ＤＮＡ快速提取方法［Ｊ］．山西大学学报（自然科学版），　２０００，２３（３）：２７１—２７２．　品无降解、无缺样，粗提ＤＮＡ即可用于ＲＡＰＤ和ＳＳＲ　分子标记分析。　［５］　高文伟，李晓辉，李新海．玉米单粒和单叶片ＤＮＡ快速　提取及ＳＳＲ标记分析［Ｊ］．玉米科学，２００４，１２（２）：１１１　—１１３．　综合分析认为，利用异硫氰酸胍法并结合组织　研磨器提取玉米叶片基因组ＤＮＡ的方法，具有使用　药品少、操作步骤简单、快速、成本低、ＤＮＡ质量稳　定可靠等优点，可以在玉米分子标记辅助育种工作　１６ｊ　Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｋ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　Ｃ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｃ．Ａ　Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１９（６）：１３４９．　［７］张博，张露，诸葛强，等．一种高效的树木总ＤＮＡ　提取方法［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），　２００４．２８（１）：１３—１６．　中应用。利用该套ＤＮＡ提取技术，每人每个工作日　可以提取３００个以上的ＤＮＡ样品，满足了大样本容　［８］　田清震，李新海，李明顺，等．优质蛋白玉米的分子　标记辅助选择［Ｊ］．玉米科学，２００４，１２（２）：１０８—１１０；　１１　３．