免疫组化IHC小白入门攻略。教你如何一步步搞定免疫组化

IHC简而言之，统共分成七步：脱蜡／复水，抗原修复，淬灭（去除内源性过氧化物酶），封闭，抗体孵育及DAB显色。前三步形似泡澡堂，后三步形似Western blot。

1.泡澡之前，我们得脱衣服，脱蜡就是给石蜡切片“脱衣服”的过程，即，用二甲苯将石蜡从切片上“脱”下来，总共脱3次，每次5min。在进澡堂子之前，我们得穿上澡堂提供的浴袍，让自己融入澡堂的环境。复水的目的就是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容。这一步中，我们使用100%乙醇和95%乙醇各洗切片2次，每次10min。

2.接下来，我们就能进入IHC中极为重要的一步——抗原修复。抗原修复的目的是将抗原表位得以暴露，使得后续的一抗可以结合上去。目前而言，抗原修复的方式主要分为热修复和酶修复两种，其中热修复是在微波炉或者高压锅中，切片在沸腾温度（95-99℃）加热一段时间后完成，所用到的修复液主要有柠檬酸缓冲液（pH＝6.0），EDTA（pH＝8.0）和TE（pH＝9.0）三种；酶修复则是在37℃温箱中进行，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶K进行的酶解作用达到抗原修复的目的，使用这种修复方式需注意对修复液进行预热，使其在切片放入前，就已达到酶类的最佳反应温度。

抗原修复是IHC中最重要的一环，目的蛋白抗原表位的修复效果影响着后续的一抗结合效果，即影响着最终的结果。在实验开始前，仔细阅读抗体说明书，查看其推荐的修复条件。跟泡澡体验相似的是，人太多体验感就差，同理，在修复时不要贪多贪快，微波炉中一次只修复一缸，并根据容器体积，加入其推荐的修复液的量（推荐用量为250ml）。

此外为了保证实验具有良好的重复性，我们推荐使用浓缩修复液，这不仅简化了实验准备工作，而且使实验批次间所使用的修复液组分达到更佳的稳定性。

3.在上述大事完成后，我们进行的是IHC特色项目——淬灭（即去除内源性过氧化物酶）。目前绝大多数IHC都是基于HRP检测系统，所以我们需要去除组织中内源性过氧化物酶的活性。只需在3%H2O2中浸泡10min即可。

此时的切片，便形似一张湿转后的western blot膜——方方的载体上分布着我们的蛋白。

4.为了减少二抗与组织的非特异结合，我们需使用二抗来源的血清进行封闭。由于绝大多数一抗为鼠抗（mouse）和兔抗（rabbit），对应的二抗来源于羊（goat），所以我们使用5%正常羊血清（溶剂为TBST），将其滴加到组织上，室温封闭1h即可。我们也可以使用CST新推出的不含动物组分的封闭液，以达到更佳、更具实验稳定性的封闭效果。

5. 擦去封闭液后（后方的同志注意了，不是洗去！不是洗去！不是洗去！），如同western blot一样，我们可以进行一抗孵育。一抗的特异性对染色结果有着至关重要的作用。正所谓抗体选不好，Figure有烦恼；抗体一跑偏，结果就坑爹。为了提高实验的成功率及可信度，一定要选择经过周密严格验证的高大上抗体，并根据说明书的提示，使用特定的稀释体系配置抗体工作液。

6. 敷有一抗的切片在4℃过夜并经洗涤后，进行二抗孵育。二抗的效力及其与一抗的契合度也影响着染色结果。

7.二抗孵育并洗涤后，将新鲜配置的DAB显色液滴加至切片上，进行显色反应，即棕黄色颗粒的形成。在显色过程中，需对切片严密监控以控制合适的显色程度（一般1-10min），当获得合适的染色强度后，将切片浸泡于dH2O中，终止显色。

8.显色结束后，可以根据实验需要进行核复染。核复染可以凸显细胞结构，并有利于结果的观察和判读。目前，多数研究者使用的核复染试剂为苏木精，将细胞核染成蓝色。

9.最后，对切片进行脱水、封片（DAB显色系统，可使用中性树胶）。就能在显微镜下细细端详品读实验结果啦。