睾酮检测试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112129955 A(43)申请公布日 2020.12.25

(21)申请号 201910554532.2(22)申请日 2019.06.25

(71)申请人 迈克生物股份有限公司

地址 611731 四川省成都市高新区百川路

16号(72)发明人 马洪超　张文娅　张凌燕　(51)Int.Cl.

G01N 33/74(2006.01)G01N 33/543(2006.01)

权利要求书1页 说明书16页

(54)发明名称

睾酮检测试剂盒(57)摘要

本申请涉及一种睾酮检测试剂盒及其使用

试剂R2和试剂R3，方法，该试剂盒中包括试剂R1、

其中，试剂R1中含有链酶亲和素磁微粒，试剂R2中含有化学发光物质标记的抗睾酮抗体，试剂R3中含有生物素化睾酮，试剂R2和/或试剂R3中还含有抗干扰剂。本发明提供的试剂盒稳定性高、灵敏性高、准确性高和抗干扰能力强，能够满足使用要求。

CN 112129955 ACN 112129955 A

权　利　要　求　书

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1.一种睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂R1、试剂R2和试剂R3；所述试剂R1包含链酶亲和素磁微粒和基础缓冲液；

所述试剂R2包含被可检测标记物标记的抗睾酮抗体和基础缓冲液；所述试剂R3包含生物素化睾酮和基础缓冲液；

所述试剂R2和试剂R3中至少一种还包括抗干扰剂，所述抗干扰剂选自生物素、生物素衍生物中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述抗干扰剂在试剂R2或试剂R3中的浓度为5～100ng/mL。

3.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述抗干扰剂与生物素化睾酮的浓度比例为0.5:1～2.5:1。

4.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物为酶、荧光染料、放射性标记物、同位素标记物或发光物质；优选地，所述可检测标记物为化学发光物质；优选地，所述可检测标记物为吖啶类化学发光物质；优选地，所述可检测标记物为吖啶酯衍生物。

5.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述基础缓冲液包括pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂。

6.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中还包括消泡剂，优选地，所述消泡剂选自聚醚类消泡剂、硅类消泡剂中的一种或几种。

7.根据权利了要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中还包括睾酮释放剂；优选地，所述睾酮释放剂选自雌二醇、雌二醇衍生物中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括睾酮抗原和校准品稀释液，所述校准品稀释液包括pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂。

9.根据权利要求8所述的睾酮检测试剂盒，其特征在于，所述校准品稀释液包括牛血清白蛋白；优选地，所述牛血清白蛋白的含量为20～90g/L。

10.根据权利要求1-9任一项所述的睾酮检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下内容：将待测样品与试剂R2混合并孵育完成后，再加入试剂R1和试剂R3进行孵育。

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说　明　书睾酮检测试剂盒

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技术领域

[0001]本发明属于睾酮检测技术领域，具体涉及一种睾酮检测试剂盒。

背景技术

[0002]睾酮(Testosterone，T)是一种甾体化合物，分子量288.4D，是循环系统中最重要的雄性激素。男性中，睾酮主要在睾丸间质细胞(也称Leyding细胞)中合成，受促黄体激素的调节，对于男性第二性征的发育及性腺机能减退的鉴别诊断起重要作用。男性睾酮水平升高见于完全性激素抵抗，而降低常见原因为：性腺机能减退、睾丸切除术、雌激素治疗、Klinefelter综合征、垂体机能减退和肝硬化等。女性中，睾酮由卵巢和肾上腺成并分泌。正常情况下女性睾酮水平远低于健康男性。女性体内睾酮水平升高原因包括：多囊卵巢综合征、肾上腺增生等。女性睾酮水平过高在临床上表现为不育、多毛征和闭经等。[0003]目前，睾酮多采用放射免疫分析法和酶联免疫法进行检测。但这些方法均存在一些不足：酶联免疫法灵敏度不高、检测范围窄、容易受到干扰，无法满足临床大量样本准确检测的要求；放射免疫分析法中的射性元素对环境会产生污染，且放射元素的半衰期短会给操作使用带来不便，也限制了其应用。

[0004]化学发光免疫分析是近年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽，是免疫学检测的重要发展方向。[0005]但适用于睾酮测定的、具有稳定性高、灵敏性高、准确性高、抗干扰能力强的化学发光免疫检测试剂盒，依然是目前需要解决的问题。发明内容

[0006]鉴于此，本发明提供一种具有稳定性高、灵敏性高、准确性高、抗干扰能力强的睾酮检测试剂盒，其包含试剂R1、试剂R2和试剂R3。试剂R1中包含链酶亲和素磁微粒和基础缓冲液；试剂R2中包含被可检测标记物标记的抗睾酮抗体和基础缓冲液；试剂R3中包含生物素化睾酮和基础缓冲液；试剂R2和试剂R3中至少一种还包括抗干扰剂，该抗干扰剂选自生物素、生物素衍生物中的一种或几种。[0007]本发明中，“链酶亲和素磁微粒”是指链酶亲和素蛋白包被的磁性微粒。对于“链酶亲和素磁微粒”的用量，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，比如，其浓度可以采用例如0.01～1.0mg/mL，其浓度也可以是0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1.0mg/mL。[0008]本发明中，“可检测标记物”是指一类可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段可检测的物质，例如酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和ELISA中常用的其它酶)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明和绿色荧光蛋白等，参见例如Molecular Probes,Eugene,Oreg.,USA)、放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、发光物质(例如，化学发光物质，进一步地，例如吖啶(例如吖啶-9-羧酰

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胺)、啡啶(phenanthridinium)、二氧杂环丁烷(dioxetanes)和鲁米诺等)、比色标记物(例如，胶体金，进一步地，例如粒径为40nm～80nm的金颗粒高效地散射绿光)或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠子。[0009]作为优选，“可检测标记物”为化学发光物质。“化学发光物质”是指一类经催化剂的催化和/或氧化剂的氧化,形成一激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子的物质。[0010]作为优选，“可检测标记物”为“吖啶类化学发光物质”。“吖啶类化学发光物质”是指吖啶酯及其衍生物、吖啶磺酰胺化学发光物质和光泽精，其适用于化学发光免疫分析系统。在碱性H2O2溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出光子。[0011]优选地，“可检测标记物”为“吖啶酯衍生物”。吖啶酯衍生物”在化学发光免疫分析领域中是众所周知的，例如中国专利201510090045.7中记载了用于化学发光免疫分析的吖啶酯衍生物及其制备方法；Law等(Novel poly-substituted aryl acridinium esters and their use in immunoassay,J Biolumin Chemilumin.1989Jul；4(1):88-98)合成了一系列可用于免疫分析的吖啶酯类似物。[0012]本发明中，“抗睾酮抗体”是指特异性结合睾酮的免疫球蛋白分子及其片段，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白；还涉及重组或合成的抗体。以及，还涉及“抗体的片段”，即通常包括抗体的抗原结合区，轻链和/或重链可变区，一个或多个(如六个)CDR的至少一部分，其保留亲代抗体的至少一定的结合特异性。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体分子；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当基于摩尔来表达活性时，片段保留至少50％的对小分子化合物的结合活性。优选地，和亲代抗体相比，片段保留至少60％、70％、80％、90％、95％或100％的对小分子化合物的结合活性。

[0013]本发明中，试剂R2中包含的“抗睾酮抗体”是指被“可检测标记物”标记的“抗睾酮抗体”。用可检测标记物对抗体进行标记是本领域众所周知的。被可检测标记物标记的抗睾酮抗体及其用量，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，比如，采用吖啶酯标记的鼠抗睾酮单克隆抗体，其浓度可以采用例如0.01～1.0μg/mL，其浓度也可以是0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.03μg/mL、0.04μg/mL、0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1.0μg/mL。[0014]本发明中，“生物素化睾酮”是指生物素修饰的睾酮或其衍生物。“睾酮衍生物”是指含有可用于偶联的活性基团的睾酮，其分子上所修饰的活性基团并不影响其免疫反应性。生物素化睾酮的用量，可根据实际情况进行选择，比如，其浓度可以采用例如0.2～200ng/mL，其浓度也可以是0.2ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、160ng/mL、180ng/mL或200ng/mL。[0015]本发明中，“基础缓冲液”是指一类具有盐平衡、pH缓冲、保护活性成分结构和生物学特性的溶液。该基础缓冲液包括pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂。[0016]“pH值调节剂”，是指能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定的试剂。对于pH值调节剂的种类，本发明选自磷酸缓冲

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液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种；对于pH值调节剂的用量，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，例如，在使用磷酸缓冲液时可以采用0.5～20g/L的浓度。[0017]“无机盐离子”是指一类维持溶液的离子浓度处于相对稳定平衡状态的试剂。对于无机盐离子的种类，本发明选自氯化钠、氯化钾中的一种或多种；对于无机盐离子的用量，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，例如，在使用氯化钠时可以采用5～20g/L的浓度。

[0018]“表面活性剂”是指加入少量能够使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，其具有固定的亲水亲油基团且在溶液的表面能够定向排列。对于表面活性剂的种类，本发明可选自Tween、SPAN、曲拉通、EMULGEN系列表面活性剂(如吐温20、吐温40和曲拉通100)以及月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3ARAMT1、SHO62C和AMPHITOL中的一种或几种；对于表面活性剂的用量，本领域技术人员能够根据实际情况进行选择，比如，在使用吐温20或曲拉通100时可以采用例如0.01～5.0mL/L的浓度，优选为0.1～0.5mL/L。[0019]“稳定剂”是指一类其稳定作用的试剂，优选地，选自甘露醇、牛血清白蛋白、丙三醇、海藻糖、酪蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和羟乙基淀粉中的一种或多种；对于稳定剂的用量，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，例如5～40g/L的浓度，又例如，5g/L、10g/L、20g/L、30g/L或40g/L的浓度。[0020]本发明中，“生物素衍生物”是指生物素的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代的一类化合物，例如，生物素酯。[0021]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒中，抗干扰剂的加入浓度可为5～100ng/mL，即，抗干扰剂在试剂R2或试剂R3中的浓度为5～100ng/mL，例如，5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。[0022]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒中，抗干扰剂的浓度与生物素化睾酮的浓度的比例为0.5:1～2.5:1，例如，比例可以为0.5:1、1:1、1.3:1、1.5:1、1.8:1、2.0:1、2.2:1或2.5:1。申请人在试验过程中，意外发现加入生物素等抗干扰剂，能显著抵抗样品中生物素的干扰，提高检测结果的准确性。[0023]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒中，在试剂R1中还包括消泡剂。对于消泡剂的种类，可选自聚醚类消泡剂、硅类消泡剂中的一种或几种；对于消泡剂的用量，可选自0.01～1μL/L。

[0024]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒中，在试剂R2中还包括睾酮释放剂，优选为雌二醇及其衍生物，用量为0.1～10μg/mL，例如，0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL。[0025]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒，还包括校准品，该校准品包括睾酮抗原和校准品稀释液。[0026]本发明中，“校准品稀释液”即为对睾酮抗原进行稀释、且保护睾酮抗原结构和功能的溶液。该校准品稀释液包括pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂。[0027]pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂的种类选择与上述“基础缓冲液”中的相应成分的选择相似，其中，pH值调剂剂的用量范围为2～20g/L；无机盐离子的用量范

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围为1.0～10g/L；表面活性剂的用量范围为0.1～10mL/L；稳定剂的用量范围为3～300g/L。[0028]作为优选，本发明提供的睾酮检测试剂盒，在校准品稀释液中包括牛血清白蛋白；牛血清白蛋白的含量优选为20～90g/L、更优选为20～80g/L、30～70g/L、30～60g/L或30～50g/L。申请人通过试验，意外发现在校准品稀释液中添加上述浓度范围的牛血清白蛋白，不仅能提高校准品的稳定性，还能提高校准曲线的特异性、提高检测结果的准确性。[0029]本发明的另一个目的，提供睾酮检测试剂盒的使用方法，包括以下内容：将待测样品与试剂R2混合并孵育完成后，再加入试剂R1和试剂R3进行孵育。[0030]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的睾酮检测试剂盒，在试剂R2和/或试剂R3中含有抗干扰剂，能抵抗样品中生物素的干扰，提高检测结果的准确性；在试剂R1中含有消泡剂，防止与磁微粒混匀时出现气泡而影响加样，提高了检测体系的稳定性；在校准品中含有特定浓度的牛血清白蛋白，具有稳定性好，便于使用和保存，且能提高检测结果的准确性。此外，采用本发明的睾酮检测试剂盒，并结合本发明提供的使用方法，可进一步提高睾酮检测的灵敏性和准确性。具体实施方式

[0031]为了使本领域技术人员更好地了解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域平台技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，例如，对试剂盒中的常规试剂(如pH值调节剂、无机盐离子、表面活性剂和稳定剂)的成分选择及用量范围选择，都应当属于本申请保护的范围。[0032]以下具体实施例中涉及的试剂成分均为市售产品，例如，链酶亲和素磁微粒购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：XCL1026)，生物素化睾酮购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：XCL1495)，生物素(又名：维生素H)购自成都市科隆化学品有限公司，消泡剂购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：XCL1602)，雌二醇购自Toronto Research Chemicals，牛血清白蛋白购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：XCL1353)。其中，以下实施例中采用的吖啶酯标记的抗睾酮抗体，是指将市售的吖啶酯标记鼠抗睾酮单克隆抗体后的试剂成分，其中，鼠抗睾酮单克隆抗体购自四川迈克生物新材料技术有限公司(货号：XCL1343)。[0033]实施例1

[0034]1.1睾酮检测试剂盒1的配制[0035]分别按下表配制试剂R1、试剂R2和试剂R3：

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[0037][0038][0039]

1.2睾酮检测试剂盒2的配制分别按下表配制试剂R1、试剂R2和试剂R3：

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1.3抗干扰效果考察

[0042]取5例待检测样本，采用上述睾酮检测试剂盒1和睾酮检测试剂盒2分别进行检测；然后将检测样本中分别加入10ng/mL生物素，采用上述睾酮检测试剂盒1和睾酮检测试剂盒2分别进行检测；检测结果见下表：

[0041]

[0043]

上表中，“对照测定值”表示样本中没有加入生物素干扰时测定的睾酮浓度；“干扰测定值”表示在对应样本中加入了10ng/mL生物素，产生生物素干扰时测定的睾酮浓度。从上表可以看出，睾酮检测试剂盒1对同一样本中、加入和不加入生物素测得的值差异小(偏差＜10％)，而睾酮检测试剂盒2检测得到的结果差异较大(偏差＞10％)，说明睾酮检测试剂盒1的抗生物素干扰效果好，而睾酮检测试剂盒2的抗生物素干扰效果差。[0045]1.4稳定性考察[0046]配制主校准品，每个校准品中加入的睾酮抗原浓度分别为：CalA：0-0.1ng/mL；CalB：0.2-0.6ng/mL；CalC：0.5-1.5ng/mL；CalD：3.0-7.0ng/mL；CalE：20.0-30.0ng/mL。[0047]将4℃放置的睾酮检测试剂盒1和睾酮检测试剂盒2，对上述的主校准品进行检测，然后将上述两种试剂盒置于37℃环境中放置7天后，对上述的主校准品进行检测，得到的校准曲线信号值、校准曲线信号保留率见下表：

[0044]

[0048]

[0049]

上表中，“4℃信号值”是指将睾酮检测试剂盒1或睾酮检测试剂盒2在4℃环境中放

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置后测得的校准曲线信号值；“37℃信号值”是指将睾酮检测试剂盒1或睾酮检测试剂盒2在37℃环境中放置7天后测得的校准曲线信号值；“信号保留率”是指同一校准品情况下，“37℃信号值”与“4℃信号值”的百分比，“信号保留率”越高，说明其稳定性越好。从上表可以看出，相比于睾酮检测试剂盒2，睾酮检测试剂盒1的稳定性更好。[0050]1.5免疫试验考察[0051]用睾酮检测试剂盒1和睾酮检测试剂盒2分别检测20例随机样本，检测结果如下表：

[0052]

从上表可以看出，睾酮检测试剂盒1相比于睾酮检测试剂盒2，其试剂R3中加入了

生物素，但两种试剂盒的检测结果差异小，说明试剂R3中加入生物素后不影响其免疫反应性。

[0054]实施例2

[0055]2.1睾酮检测试剂盒3的配制

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[0053]

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分别按下表配制试剂R1、试剂R2和试剂R3：

[0058]

2.2抗干扰效果考察

[0060]采用实施例1中“1.3抗干扰效果考察”相同的方法，只是将睾酮检测试剂盒1替换成睾酮检测试剂盒3，结果发现，在试剂R2中添加了生物素的睾酮检测试剂盒3的抗干扰效果显著优于没有添加生物素的睾酮检测试剂盒2。[0061]2.3稳定性考察[0062]采用实施例1中“1.4稳定性考察”相同的方法，只是将睾酮检测试剂盒1替换成睾酮检测试剂盒3，结果发现，在试剂R2中添加了生物素的睾酮检测试剂盒3的稳定性较好，甚至优于没有添加生物素的睾酮检测试剂盒2。[0063]2.4免疫试验考察[0064]采用实施例1中“1.5免疫试验考察”相同的方法，只是将睾酮检测试剂盒1替换成睾酮检测试剂盒3，结果发现，睾酮检测试剂盒3与睾酮检测试剂盒2的免疫原性相当，说明在试剂R2中添加生物素不会影响试剂盒的免疫原性。[0065]2.5生物素添加量考察

[0066]在睾酮检测试剂盒3的基础上，对其试剂R2中生物素的添加量进行考察，生物素添加量分别为5ng/mL、30ng/mL以及50ng/mL，得到3种生物素添加量的睾酮检测试剂盒，并将这3种试剂盒采用实施例1中“1.3抗干扰效果测定”相同的方法，对3例样本进行检测，结果见下表：

[0059]

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与“1.3抗干扰效果测定”类似，“对照测定值”表示样本中没有加入生物素干扰时

测定的睾酮浓度；“干扰测定值”表示对应相同的样本中加入了10ng/mL生物素，产生生物素干扰时测定的睾酮浓度。从上表可以看出，在试剂R3中生物素化睾酮相同的情况下，试剂R2中生物素的添加量对抗干扰效果有不同的影响，本领域技术人员在本申请公开内容的基础上，能够根据具体情况(例如生物素化睾酮的含量)，合理地调整试剂R2中生物素的含量，以实现更佳的抗干扰效果。申请人还发现，在试剂R3中生物素的添加量也有与在试剂R2中相似的效果。

[0069]实施例3

[0070]3.1校准品稀释液的配制

[0071]分别按照下表配制3种不同的校准品稀释液：

[0068]

[0072]

3.2稳定性考察

[0074]用上述校准品稀释液1、校准品稀释液2和校准品稀释液3分别配制主校准品，其中，每种校准品中加入的睾酮抗原浓度分别为：CalA：0-0.1ng/mL；CalB：0.2-0.6ng/mL；CalC：0.5-1.5ng/mL；CalD：3.0-7.0ng/mL；CalE：20.0-30.0ng/mL。

[0075]将不同校准品稀释液配制的不同睾酮抗原浓度的主校准品放置于4℃环境下，然后采用实施例1中的睾酮检测试剂盒1对上述稀释后的主校准品进行检测；然后，将上述不同校准品稀释液配制的不同睾酮抗原浓度的主校准品放置于37℃环境中放置7天后，再采用实施例1中的睾酮检测试剂盒1进行检测，得到的校准曲线信号值、校准曲线信号保留率

[0073]

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见下表：

[0076]

[0077]

上表中，“4℃信号值”是指将不同校准品稀释液配制不同睾酮抗原浓度的主校准

品在4℃环境中放置后测得的校准曲线信号值；“37℃信号值”是指将不同校准品稀释液配制不同睾酮抗原浓度的主校准品在37℃环境中放置7天后测得的校准曲线信号值；“信号保留率”是指同一校准品情况下，“37℃信号值”与“4℃信号值”的百分比，“信号保留率”越高，说明其稳定性越好。从上表可以看出，由校准品稀释液2和校准品稀释液3配制的校准品的稳定性相当，其稳定性均显著优于由校准品稀释液1配制的校准品，并且，校准品稀释液2和校准品稀释液3得到的校准曲线的特异性均较高。[0079]3.3准确性考察

[0080]将上述3.1中的3种校准品稀释液分别配制主校准品，采用实施例1中睾酮检测试剂盒1，测定8份随机样本，校准品应在样本测定前测定，通过校准规则校准结果，测定出的样本结果以校准品的校准结果为准。[0081]为对比检测结果的准确性，采用雅培公司的睾酮测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)(试剂盒货号为：2p13-28；校准品货号为：2p13-01)，对上述8份样本进行检测，雅培公司的试剂盒中各试剂成分如下：

[0082]

[0078]

实施例1中睾酮检测试剂盒1分别配套上述3.1中3种校准品稀释液配制的校准品，

以雅培公司的试剂盒为对比，测定结果见下表：

[0083]

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[0085]

上表中，“对比厂家测定值”是指采用对比厂家(雅培公司)检测得到的样本中睾酮

含量，“测定值”是指采用实施例1中睾酮检测试剂盒1分别配套校准品稀释液1/2/3配制的校准品，测得的睾酮含量值。从上表可以看出，校准品稀释液中牛血清白蛋白的含量会影响试剂盒检测的准确性，使用校准品稀释液2配制的主校准品校准后测定样本结果更准确。[0087]实施例4

[0088]该实施例中采用的是实施例2中的睾酮检测试剂盒3，配套的是实施例3中的校准品稀释液2配制的主校准品，其中，校准品中加入的睾酮抗原浓度分别为：CalA：0-0.1ng/mL；CalB：0.2-0.6ng/mL；CalC：0.5-1.5ng/mL；CalD：3.0-7.0ng/mL；CalE：20.0-30.0ng/mL。[0089]4.1睾酮检测试剂盒的使用方法1[0090]先加入样本、试剂R2和试剂R3进行共同孵育，然后加入试剂R1进行孵育，孵育完成后，洗涤，将未结合的样本试剂去除。加入发光底物，检测相对发光值(RLU)。[0091]4.2睾酮检测试剂盒的使用方法2[0092]先加入样本和试剂R2进行孵育，然后再加入试剂R3和试剂R1进行孵育，孵育完成后，洗涤，将未结合的样本试剂去除。加入发光底物，检测相对发光值(RLU)。[0093]4.3灵敏性考察[0094]分别采用“4.1睾酮检测试剂盒的使用方法1”和“4.2睾酮检测试剂盒的使用方法2”的方法对主校准品进行检测，得到的校准曲线见下表：

[0086]

[0095]

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从上表可以看出，随着校准品中睾酮抗原浓度的变化，采用睾酮检测试剂盒使用

方法2测得的信号值变化程度更大，也就是说，睾酮检测试剂盒使用方法2的检测灵敏度更高。

[0097]4.4准确性考察[0098]分别采用“4.1睾酮检测试剂盒的使用方法1”和“4.2睾酮检测试剂盒的使用方法2”的方法对20份随机样本进行检测，校准品应在样本测定前测定，通过校准规则校准结果，测定出的样本结果以校准品的校准结果为准。[0099]同时，为对比检测结果的准确性，采用雅培公司的睾酮测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)(试剂盒货号为：2p13-28；校准品货号为：2p13-01)，对上述20份随机样本进行检测。检测结果见下表：

[0100]

[0101]

从上表可以看出：采用“4.2睾酮检测试剂盒的使用方法2”的方法，检测得到的结果与对比厂家的一致性更高，即采用睾酮检测试剂盒的使用方法2测定的样本结果更加准确。

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实施例5

5.1试剂R1的基础缓冲液按照下表配制基础缓冲液：

[0105]

[0106]

[0107][0108][0109]

5.2试剂R1的磁微粒缓冲液按照下表配制磁微粒缓冲液：

原料用量磷酸氢二钠2.56g/L磷酸二氢钠0.436g/L氯化钠9.00g/L甘露醇20.00g/L牛血清白蛋白(B)10.00g/L4-氨基安替比林0.02g/LTX-1000.10mL/L生物防腐剂PC-3003.00mL/L丙三醇10.00mL/L消泡剂0.05μL/L纯化水定容至1L[0110]5.3自然重力下的沉降考察：[0111]取磁微粒7mL，分别使用5.1和5.2中的两种缓冲液洗涤磁微粒3次，然后用上述两种缓冲液分别对磁微粒进行重悬，混匀，平分为7份，每份1mL。隔一段时间取100μL上清液用多功能读数仪(Thermo)测定其在550nm处的吸光度值，结果如下：

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从上表看出：磁微粒在基础缓冲液中的自然沉降速率较其在磁微粒缓冲液中快，

且在30min时，可以清晰的观察到磁微粒在基础缓冲液中自然沉降30min时，接近液面的上清液已经澄清透明，而在磁微粒缓冲液中上清仍是混悬液，没有明显的分层界线。[0114]5.4磁场作用下的磁分离效果考察

[0115]方法基本同5.3自然重力下的沉降考察类似，只是将平分后的磁微粒置于2800高斯的磁场下，磁分离0s、10s、20s、30s和45s时取100μL磁分离后的上清液，测定其在550nm处的吸光度值，结果如下：

[0116]

[0113]

从上表可看出：在磁场环境下时，磁微粒在基础缓冲液和磁微粒缓冲液中的磁分离速率差异不明显，30s时的磁分离率都在92％以上。[0118]5.5消泡效果考察

[0119]对于大包装的化学发光磁微粒试剂，每次测定前均需对磁微粒组份进行混匀，当剩余体积较少时，磁微粒混匀后易产生气泡，导致随后测定过程中出现试剂针空探现象。分别使用5.1和5.2中的两种缓冲液配制磁微粒，在迈克生物股份有限公司的全自动化学发光仪上执行磁微粒混匀程序，5秒内裸眼观察起泡比例，结果如下：

[0117][0120]

测定次数1234567891011125.1基础缓冲液50％90％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％

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5.2磁微粒缓冲液无无无无无无无无无无无无

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[0121]

100％无100％无100％无

从上表可看成：磁微粒缓冲液在磁珠混匀过程中产生气泡的比例明显低于基础缓

冲液。

[0122]

5.6免疫试验考察

[0123]分别采用5.1基础缓冲液和5.2磁微粒缓冲液配制试剂R1，睾酮检测试剂盒中的试剂R2、试剂R3与实施例1中的对应成分相同，采用全自动免疫分析化学发光仪测定25例临床样本，观察两种缓冲液在免疫试验应用中是否有影响，检测结果如下：

[0124]

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从上表看出：5.2磁微粒缓冲液与5.1基础缓冲液相比，增加了消泡剂成分，但两种

缓冲液配制的检测试剂盒所测得的结果差异小，即试剂R1中加入消泡剂后不影响其免疫反应性。

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