一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103554252 A(43)申请公布日 2014.02.05

(21)申请号 201310573517.5(22)申请日 2013.11.15

(71)申请人同路生物制药股份有限公司

地址230022 安徽省合肥市绩溪路230号(72)发明人邓坤 胡辉恒 汪模正 邵恒波(74)专利代理机构北京双收知识产权代理有限

公司 11241

代理人王菊珍(51)Int.Cl.

C07K 16/06(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/16(2006.01)

权利要求书2页 说明书7页权利要求书2页 说明书7页

(54)发明名称

一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法(57)摘要

本发明公开了一种巨细胞人免疫球蛋白，其巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:400，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的96%，本发明还公开了所述巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）筛选出巨细胞病毒中和抗体效价滴度大于等于1:50的血浆原料；（2）制备混合血浆供试品；（3）将所述混合血浆供试品按低温乙醇或层析法蛋白分离方法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置后分装得到产品。本发明所述巨细胞人免疫球蛋白可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒感染症的有效药物，具有较大的社会效益和经济效益。CN 103554252 ACN 103554252 A

权 利 要 求 书

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1.一种巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于：其巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:400，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的96%。

2.根据权利要求1所述的巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白与正常人血清相比，主要沉淀线为IgG。

3.根据权利要求2所述的巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于96%。

4.根据权利要求1所述的巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干剂型。

5.权利要求1～4中任意一项权利要求所述巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）用中和试验法筛选出巨细胞病毒中和抗体效价滴度大于等于1:50的血浆原料；（2）以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆供试品的巨细胞病毒中和抗体效价滴度大于等于1:80；

（3）将所述混合血浆供试品按低温乙醇压滤结合层析法蛋白分离方法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置后分装得到产品。

6.根据权利要求5所述的巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述中和试验法具体包括如下步骤：

（A）样品稀释：

血浆样本用细胞维持液预先进行1：10稀释后56℃灭活30分钟；打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板上标示该板试验样品的编号；

在样品试验板的各样品孔中加入40ul细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μl细胞维持液；

将预先灭活的样品液分别加入到相应96孔细胞板的相应位置，每孔加样品10μl，每样品平行做两孔；

所述细胞维持液为体积比为5%的胎牛血清的DMEM液；（B）攻击病毒

制备攻击病毒液：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将应用病毒要稀释到100CCID50/0.05ml；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μl含100CCID50的攻击病毒液；

回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10－1、10－2、10－3稀释，将攻击病毒液与其10－1、10－2、10－3浓度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μl/孔；

阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μl细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5%的培养箱中和培养2小时；（C）细胞悬液的配制与添加细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/ml，配好的细胞液立即使用或置4℃保存备用；

细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μl，约1×104个/孔；

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权 利 要 求 书

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（D）培养及观察统计

将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5%的培养箱中培养11天，病毒接种后的第7天显微镜下观察细胞生长情况，第9天观察细胞病变情况，第11天最终判定结果，并记录统计。

7.根据权利要求5所述的巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（3）具体包括如下步骤：

a)将所述混合血浆供试品在2℃下离心去除冷沉淀；b)去除冷沉淀后的血浆用生理盐水稀释成反应液，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节所述反应液pH值至6.5，加体积百分比95%乙醇至所述反应液中，使最终乙醇体积百分比为20%，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离得沉淀；

c)将步骤b)获得的沉淀用0℃、10倍0.01mol/L的NaCl溶液搅拌并溶解；d)向步骤c)所得的溶解液中加体积百分比50%乙醇形成反应液，使最终乙醇体积百分比为17%，以醋酸缓冲液调节反应液的pH值至5.1，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离除去沉淀，收集上清液；

e)将步骤d)收集的上清液超滤透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱阴离子交换层析，反应温度为10℃，收集流出液；

f)将步骤e)的流出液进行再超滤，以醋酸缓冲液调节pH值至4.0，温度至10℃；g)透析8遍后浓缩；

h)将浓缩后获得的浓缩液用2mol/L的冰醋酸调pH至3.85，加入质量百分比为30%的麦芽糖使最终浓度在10%作为保护剂，补加生理盐水使蛋白质量百分含量为5.8%，得到原液；

i)将所述原液在24～25℃下孵放21天后用纳米膜过滤的双病毒灭活处理；j)无菌分装后得到产品。

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说 明 书

一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法。

背景技术

巨细胞病毒CMV（Cytomegalovirus）是疱疹病毒科β属的DNA病毒，由巨细胞病

毒引起的孕妇、新生儿、器官移植患者、免疫抑制者感染死亡率可达50～80%。巨细胞病毒人免疫球蛋白CMV-IgG因能特异中和巨细胞病毒，临床上主要用其治疗孕妇、新生儿、免疫抑制患者及器官移植手术印发的巨细胞病毒重症感染。普通人群中的巨细胞病毒自然感染率可达80%以上，从健康人群中筛选并采集含高效价巨细胞病毒IgG抗体的血浆，采用低温乙醇工艺分离纯化方法制备巨细胞人免疫球蛋白药物，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。

[0002]

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供提供一种有效治疗巨细胞病毒重症感染的人免

疫球蛋白及其制备方法。

[0004] 一种巨细胞人免疫球蛋白，其巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:400，免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的96%。

[0005] 本发明所述的巨细胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白与正常人血清相比，主要沉淀线为IgG。

[0006] 本发明所述的巨细胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的IgG单体及二聚体含量之和大于等于96%。

[0007] 本发明所述的巨细胞人免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干剂型。

[0008] 一种巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：[0009] （1）用中和试验法筛选出巨细胞病毒中和抗体效价滴度大于等于1:50的血浆原料；

[0010] （2）以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆原料由不少于500名供血浆者的所述血浆原料混合而成，所述混合血浆供试品的巨细胞病毒中和抗体效价滴度大于等于1:80；[0011] （3）将所述混合血浆供试品按低温乙醇压滤结合层析法蛋白分离方法，分离提取免疫球蛋白组分，经过滤、层析、超滤、病毒灭活、配置后分装得到产品。[0012] 本发明所述的巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其中，步骤（1）所述中和试验法具体包括如下步骤：[0013] （A）样品稀释：

[0014] 血浆样本用细胞维持液预先进行1：10稀释后56℃灭活30分钟；[0015] 打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板

[0003]

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说 明 书

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上标示该板试验样品的编号；

[0016] 在样品试验板的各样品孔中加入40ul细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μl细胞维持液；

[0017] 将预先灭活的样品液分别加入到相应96孔细胞板的相应位置，每孔加样品10μl，每样品平行做两孔；

[0018] 所述细胞维持液为体积比为5%的胎牛血清的DMEM液；[0019] （B）攻击病毒

[0020] 制备攻击病毒液：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将应用病毒要稀释到100CCID50/0.05ml；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μl含100CCID50的攻击病毒液；

[0021] 回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10－1、10－2、10－3稀释，将攻击病毒液与其10－1、10－2、10－3浓度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μl/孔；[0022] 阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μl细胞维持液；[0023] 将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5%的培养箱中和培养2小时；

[0024] （C）细胞悬液的配制与添加[0025] 细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/ml，配好的细胞液立即使用或置4℃保存备用；[0026] 细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μl，约1×104个/孔；[0027] （D）培养及观察统计

[0028] 将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5%的培养箱中培养11天，病毒接种后的第7天显微镜下观察细胞生长情况，第9天观察细胞病变情况，第11天最终判定结果，并记录统计。

[0029] 本发明所述的巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其中，步骤（3）具体包括如下步骤：

[0030] a)将所述混合血浆供试品在2℃下离心去除冷沉淀；[0031] b)去除冷沉淀后的血浆用生理盐水稀释成反应液，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节所述反应液pH值至6.5，加体积百分比95%乙醇至所述反应液中，使最终乙醇体积百分比为20%，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离得沉淀；[0032] c)将步骤b)获得的沉淀用0℃、10倍0.01mol/L的NaCl溶液搅拌并溶解；[0033] d)向步骤c)所得的溶解液中加体积百分比50%乙醇形成反应液，使最终乙醇体积百分比为17%，以醋酸缓冲液调节反应液的pH值至5.1，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离除去沉淀，收集上清液；

[0034] e)将步骤d)收集的上清液超滤透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱阴离子交换层析，反应温度为10℃，收集流出液；[0035] f)将步骤e)的流出液进行再超滤，以醋酸缓冲液调节pH值至4.0，温度至10℃；[0036] g)透析8遍后浓缩；

[0037] h)将浓缩后获得的浓缩液用2mol/L的冰醋酸调pH至3.85，加入质量百分比为

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说 明 书

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30%的麦芽糖使最终浓度在10%作为保护剂，补加生理盐水使蛋白质量百分含量为5.8%，得到原液；

[0038] i)将所述原液在24～25℃下孵放21天后用纳米膜过滤的双病毒灭活处理；[0039] j)无菌分装后得到产品。

[0040] 本发明所述巨细胞人免疫球蛋白与现有技术不同之处在于：

本发明提供的巨细胞人免疫球蛋白，巨细胞中和抗体效价大于等于1:256，可以针

对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒感染症的有效药物，具有较大的社会效益和经济效益。

[0042] 本发明所述制备方法的优点：[0043] （1）采用国家已有标准的巨细胞病毒株作为检测载体，从健康人群中筛选出具有较高滴度的特异性原料血浆，其标准符合《中华人民共和国药典》2010版中“生物制品生产用血浆”规定，经低温乙醇压滤工艺结合柱层析纯化制备出高滴度的巨细胞人免疫球蛋白，特异性高。[0044] （2）采用中和试验法对原料及产品进行抗体效价的检测，该方法具有操作性强，灵敏度高、特异性好的优点。[0045] （3）收集的特异性原料血浆，采用低温乙醇压滤工艺结合柱层析纯化制备出的免疫球蛋白制剂，纯度高、质量稳定。

[0041]

具体实施方式[0046] 实施例1[0047] 1、供血浆者的血浆筛选采集：[0048] 选择血浆，所选择的血浆应满足以下条件：以中和试验法检测血浆中的巨细胞中和抗体，中和效价滴度大于等于1:50；蛋白质含量（双缩脲法检测）大于等于55g/L；丙氨酸氨基转移酶（赖氏法监测）不高于35单位；乙型肝炎表面抗原阴性，梅毒阴性，HIV-1/HIV-2抗体阴性，HCV抗体阴性等均合格的巨细胞人免疫球蛋白原料血浆，低温冰冻储存，保存期不超过2年。

[0049] 中和试验法的测定方法包括如下步骤：[0050] A）以人胚肺二倍体细胞MRC-5作为指示细胞，培养液为含10%（V/V）胎牛血清的DMEM，配制细胞浓度为1×104～1×106个/ml的MRC-5细胞悬液；B)将血浆样品供试品用细胞维持液（即为体积百分比5%的胎牛血清的DMEM液，下同）进行1：10稀释后，56℃灭活30分钟。[0052] 取足够量的细胞板，在样品板中加入40ul/孔细胞维持液，然后加入相应的1：10预稀释灭活的各样品液10ul/孔，每样品平行2孔。

[0053] C)取巨细胞病毒CMV以细胞维持液稀释至试验用浓度（即100×CCID50/0.05ml）等量加入供试品板孔中，并同时设置阳性对照孔、阴性对照孔和病毒回滴孔。[0054] 病毒（阳性）对照孔：先在板孔中加入细胞维持液50ul/孔，然后加入应用病毒液50ul/孔，混匀；[0055] 细胞（阴性）对照孔：直接加入细胞维持液100ul/孔；[0056] 病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50ul/孔，然后将应用病毒液进行10倍

[0051]

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说 明 书

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比稀释后，分别取100～10-3浓度的病毒液加至相应病毒回滴孔中，50ul/孔；[0057] D)中和反应：将各板孔中液体在混匀器上小心混匀后置二氧化碳培养箱中37℃，5%CO2孵育进行中和反应2小时。[0058] E)细胞：

[0059] 细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/ml，配好的细胞液立即使用或置4℃保存备用。[0060] 细胞悬加：中和反应时间满后，每孔加细胞悬液100μl，约1×104个/孔。[0061] F)培养：将完成以上操作的细胞板放置37℃、5%CO2培养箱中培养11天，于第7天显微镜下观察细胞生长情况，第9天观察细胞病变情况，第11天最终判定结果，并记录统计。

[0062] 每次试验均须有病毒对照和细胞对照，病毒对照必须出现病变，细胞对照必须正常。结果判定：以能保护50%细胞不出现病变的供试品稀释度为中和效价。本发明中所有提到的中和试验法均是上述相同的方式进行，以下简称中和试验法。[0063] 含较高滴度的特异性血浆在投产前进行混合检测，抗体滴度不低于1:80，连续三批混合血浆检测结果见表1。

[0064] 表1.连续三批混合血浆检测结果[0065] 第一批

[0066] 检测项目蛋白含量

HCMV中和抗体效价[0067] [0068] 检测项目蛋白含量

HCMV中和抗体效价[0069] [0070] 检测项目蛋白含量

HCMV中和抗体效价[0071]

A（普通血浆）57g/L1:20

B（含较高滴度的特异性血浆）55g/L1:137

A（普通血浆）56g/L1:20

B（含较高滴度的特异性血浆）56g/L1:128

A（普通血浆）56g/L1:23

B（含较高滴度的特异性血浆）57g/L1:128

第二批

第三批

注：

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说 明 书

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1.A：为筛选后抗体滴度不符合规定的普通混合血浆

[0073] 2.B：经上述中和方法筛选获得的抗体滴度较高的特异性血浆混浆[0074] 3.以上三批血浆同一批次血浆来源相同，通过中和试验方法筛选出的高效价抗-HCMV血浆即为B，余下部分为A。[0075] 2、巨细胞人免疫球蛋白的制备：[0076] （1）将500名以上供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为300L，用中和试验法检测混奖中和效价为1:128；[0077] （2）混合后的血浆，在2℃下离心去除冷沉淀24Kg;[0078] （3）去除冷沉淀后的血浆（275L）用28L生理盐水稀释，用pH4.0醋酸缓冲液720ml调节反应液pH值至6.5，加95%乙醇75L至反应液中，使最终乙醇浓度为20%，反应液终体积为345L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离得沉淀25kg；[0079] （4）将步骤（3）的沉淀用0℃0.01mol/LNaCl溶液225L搅拌溶解，最终溶液体积为250L;

[0080] （5）在上清液中加50%乙醇128L至反应液中，使最终乙醇浓度为17%，以醋酸缓冲液1580ml调节反应液pH值至5.1，反应液终体积为380L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃，板框压滤分离除去沉淀，收集上清液为330L；[0081] （6）将上清液进行超滤透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱阴离子交换层析，反应温度为10℃，收集流出液310L。[0082] （7）将步骤（6）的流出液进行再超滤，以醋酸缓冲液3100ml调节pH值至4.0，温度至10℃。透析8遍后浓缩至22L（蛋白含量：7.2%、pH值：3.5）。[0083] （8）将步骤（7）的浓缩液用2mol/L的冰醋酸120ml调pH至3.85，加入30%麦芽糖11L使最终浓度在10%（作为病毒灭活蛋白的保护剂），补加3L生理盐水使蛋白含量为5.6%，配置最终体积为36L。[0084] （9）将上述步骤（8）所得原液在24～25℃下孵放21天后用纳米膜过滤的双病毒灭活处理；[0085] （10）将步骤(9)所得巨细胞人免疫球蛋白分装成1800瓶制品，取25瓶样品送质量检定部检定。

[0086] 以中和试验法，检测其巨细胞中和抗体效价等于1:549。[0087] 3、经大规模试生产制备所得到的样品，按照企业修订的本品制造及检定规程和《中华人民共和国药典》2010版三部的有关规定进行检定上述步骤所得的巨细胞人免疫球蛋白。结果见表2。

[0088] 表2.巨细胞人免疫球蛋白检验报告书

[0089]

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说 明 书

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[0090]

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说 明 书

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结论：本品按静注巨细胞人免疫球蛋白制造检定规程检验，结果符合规定。

[0092] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

[0091]

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