橙皮酊的微生物限度检查法验证试验

福建中医药２０１０年８月　第４１卷第４期　４１　Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＴＣＭ　Ａｕｇｕｓｔ　２０１０，４１（４）　橙皮酊的微生物限度检查法验证试验　邱　燕　（福州市药品检验所，福建福州３５０００７）　关键词：橙皮酊；微生物限度检查法；培养基稀释法；验证；菌落计数　中图分类号：Ｒ２８４　文献标志码：Ａ　文章编号：１０００—３３８Ｘ（２０１０）（ｋ：１－００４１－０２　因为药品中污染的微生物检查结果受许多因素　的影响，加上生物试验本身就存在一定的误差．这些　将直接影响样品中微生物的回收。在进行药品中微　生物检验时，只有在各种检验条件均适宜时．即在该　检验条件下的样品浓度不足以抑制污染微生物的生　长，使供试品中污染的微生物得以真实的反应，从而　保证结果的科学性准确性。　橙皮酊主要由橙皮、乙醇等组成。具有芳香健胃　的功效，为芳香性健胃药。在建立橙皮酊的微生物限　度检查方法时采用《中华人民共和国药典》Ｈ　（２００５年版一部附录）微生物限度检查法对细菌、霉　菌和酵母菌计数方法验证，对《中华人民共和国药　典》规定的５种试验菌的回收率逐一进行验证及控　制菌的检查方法验证。在培养基稀释法、离心沉淀　法、薄膜过滤法、中和法４种常用方法中选择正确的　方法降低或消除该药品抑菌作用对试验的干扰，以　证明所采用的方法适合于该药物微生物检验方法。　１试验环境与材料　１．１　试验环境在环境洁净度万级、局部洁净度百　级的单向流空气的无菌室中进行。　１．２验证菌种　枯草杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］，金黄　色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］，大肠埃希菌［ＣＭＣＣ　（Ｂ）４４１０２］，白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］，黑曲霉　［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］。　１．３稀释液ｐＨ＝７．０的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲　液（批号０９１２１７，由福州市药品检验所菌检室配制）。　１．４仪器ＳＷ—ＧＪ一１ＢＵ标准型洁净工作台，ＹＸＱ—　ＬＳ＿５ＯＳ数显立式压力蒸汽灭菌器，ＳＨＰ一２５０生化培　养箱．ＭⅨ一２５０ＢＺ霉菌培养箱。　１．５培养基营养琼脂培养基（批号０８０３０４），玫瑰　红钠琼脂培养基（批号０８１２１７），胆盐乳糖培养基ＢＬ　（批号０８１２１０），改良马丁琼脂培养基（批号０８１０３１），　ＭＵＧ培养基（批号０７１０１０），靛基质试剂（自配），以　上培养基均由北京三药科技开发公司提供。　２方法与结果　２．１　菌液制备［‘　取经３７℃培养１８～２４　ｈ的金黄　色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物稀释　至５Ｏ～１００　ｃｆｕ／ｍＬ，备用。取经２５℃培养４８￣７２　ｈ　的白色念珠菌液体培养物稀释至５０～１００　ｃｆｕ／ｍＬ，　收稿日期：２０１０－０５—１６　备用。取经２５℃培养１周的黑曲霉斜面培养物，加　３＂－＇５　ｍＬ盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，稀释至　５Ｏ～１００　ｃｆｕ／ｍＬ，备用。　２．２供试液制备ｎ叫取本品１０　ｍＬ．加ｐＨ＝７．０的　蛋白胨水氯化钠稀释液至１００　ＩＴｌＬ，振摇，作为１：１０　供试液。　２．３细菌、霉菌和酵母菌检查法的验证试验［１＿３　采　用《中华人民共和国药典》（２ｏ０５年版一部附录）微生　物限度检查法项下方法——细菌、霉菌和酵母菌用常　规法和培养基稀释法。进行３次独立的平行试验。　２．３．１　试验组　取本品１：１０供试液１　ｍＬ、５Ｏ～１００　ｃｆｕ／ｍＬ试验菌液ｌ　ｍＬ分别注入２个平皿中，倾注　琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养２４￣７２　ｈ　逐日观察结果。　培养基稀释法中取本品１：１０供试液１　ｍＬ、５Ｏ～　１００　ｃｆｕ／ｍＬ试验菌液１　ｍＬ分别注入５个平皿中，倾　注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养２４￣７２　ｈ　逐日观察结果。　２．３．２菌液组　分别取枯草杆菌、金黄色葡萄球　菌、大肠埃希菌３种菌液各ｌ　ｍＬ注入培养皿中，然　后注入４５℃营养琼脂培养基约１５　ｍＬ，待凝固后，置　３０￣３５℃培养２４￣－－４８　ｈ．逐日观察结果。分别取白色　念珠菌、黑曲霉２种菌液各１　ｍＬ注入培养皿中，然　后注入４５℃改良马丁琼脂培养基约１５　ｍＬ，待凝固　后，置２３￣２８℃培养４８￣７２　ｈ，逐日观察结果。　２．３．３供试品对照组　取本品１：１０供试液１　ｍＬ，　倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养２４～　７２　ｈ，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。　２．３．４稀释剂对照组取稀释剂１　ｍＬ，加入５Ｏ～　１００　ｃｆｕ／ｍＬ试验菌液１　ｍＬ加入平皿中．倾注琼脂培　养基，待凝固后，置规定温度培养２４￣７２　ｈ，逐１３观　察结果。　２．３．５试验结果　见表１、表２（表中Ｔ２、Ｔ３表示菌　种代数）　由表１、表２数据表明，用常规法试验组的５种　阳性试验菌株的回收率均无法达到回收要求，用培　养基稀释法可以使这５种阳性试验菌株的回收率达　到回收要求。　２．４控制菌检查方法验证试验［１　采用《中华人民　共和国药典》（２ｏｏ５年版一部附录）微生物限度检查　法项下方法——控制菌大肠埃希菌用常规法、稀释　法进行验证试验。　２．４．１　试验组　取１：１０的供试液１０　ｍＬ及１０＂－－＂　１００　ｃｆｕ试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检　查法检查。　２．４．２阴性菌对照组取１：１０的供试液１０　ｍＬ及阴　性对照菌金黄色葡萄球菌（Ｔ４，验证加菌数为５６　ｅｆｔ，），加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法检查。　２．４．３阳性对照试验取６６　ｃｆｕ的阳性对照菌大　肠埃希菌（Ｔ２）加入ＢＬ增菌培养基中，依相应控制　菌检查法检查。　２．４．４阴性对照试验取稀释剂１０　ｍＬ加入控制　菌检查用的增菌培养基中，培养。　２．４．５本底对照组　取ｌ：１０的供试液１０　ｍＬ加入　增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。　２．４．６试验结果见表３。表中“＋”表示反应呈　阳性，“一”表示反应呈阴性。　验证大肠埃希菌的阴性对照菌为金黄色葡萄球　菌（Ｔ４，验证加菌数为５６　ｃｆｕ）。　由表３验证试验得出大肠埃希菌（试验组ｌｏｏ　ｍＬ、２００　ｍＬ）ＢＬ增菌培养基经培养后ＭＵＧ呈阴性，　未检出。ＢＬ增菌培养基稀释至３００　ｍＬ后检出．阴性　菌无生长，因此采用培养基稀释法依法检查。　３讨论　霉菌和酵母茵数，结果试验组和稀释剂对照组各试　验菌株的回收率均＞７Ｏ％。　控制菌大肠埃希菌检查可采用培养基稀释法依　法检查。控制菌验证试验中设立阴性菌对照组是为　了验证该控制菌检查方法的专属性。　稀释剂对照组用以评价供试液制备方法对微生　物的影响．本次试验稀释剂对照组的回收率均＞　７０％。说明采用ｐＨ　７．０无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液作　为稀释液对试验不产生干扰。　精确测定菌数是回收率测定最为关键的步骤。　菌数太多时，不能合理反映供试品的抑菌程度，活细　胞在平板上生长重叠的几率就越高，从而影响试验　的精确度。使试验菌的回收率被低估。当菌数太低　时，回收率误差也大。为减少操作误差，一般应取每　１　ｍＬ含菌５Ｏ～１００　ｄｆｕ的菌液ｌ　ｍＬ进行验证试验。　验证试验进行３次独立平行试验，倾注培养基　时每次试验各平皿所加的培养基体积应尽量保持一　致，以使同收试验结果重现性良好。　验证试验应在阳性菌试验室进行．而不能在供　试品微生物限度检查的试验室中进行，以避免试验　菌污染无菌室的试验环境。　参考文献：　［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典［Ｍ］．北京：化学工业　出版社．２００５：７　７９．　在建立橙皮酊的微生物限度检查方法时．笔者　采用常规法、培养基稀释法。用常规法试验，结果试　验组各试验菌株的回收率均＜７Ｏ％，控制菌也未检　出。但是采用培养基稀释法测定该供试品的细菌数、　［２］　中国药品生物制品检定所．中国药品检验标准操作规范［Ｍ］．　北京：中国医药科技出版社．２００５：３１３．　［３］　苏德模，马绪荣．药品微生物学检验技术［Ｍ］．北京：华龄出　版社．２０ｏ７：１．