医学论文之 实验研究

针灸对SAMP8小鼠嗅球神经干细胞向胶质细胞分化的影响

作者：尹海燕1, 乔秀兰2, 卢圣锋1, 曾 芳1, 吴巧凤1, 魏焦禄1, 黄 梅1, 余曙光1, 唐 勇1 作者单位：1.成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610075;2.重庆市中医院，重庆 400013)

【摘要】 以SAMP8快速老化小鼠作为研究对象，采用BrdU/ S100 β、BrdU/GALC免疫荧光双标探讨针刺、艾灸治疗对嗅球神经干细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的影响。研究结果表明，艾灸可能抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，但针刺刺激主要是抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞分化，而对向少突胶质细胞分化抑制作用不明显

【关键词】 针灸疗法; 嗅球; 神经干细胞; 胶质细胞; 分化

Influence of acupuncture and moxibustion on neural stem cells differentiated into glial cell in senescenceaccelerated mouse P8 olfactory bulbYIN Haiyan1,QIAO Xiulan2,LU Shengfeng1,ZENG Fang1,WU Qiaofeng1,WEI Jiaolu1, HUANG Mei1, YU Shuguang1,TANG Yong1(1.Acupuncture School of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China; 2.Chongqing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400013, China)【Abstract】 We used immunofluorescence double staining methods(BrdU/ S100 βand BrdU/GALC) to identify neural stem cells differentiation in olfactory bulb of senescenceaccelerated mouse P8 after acupuncture and moxibustion therapy performed. The results showed that both acupuncture and moxibustion could inhibit neural stem cells from differentiating into astrocyte but only moxibustion could inhibit neural stem cells from differentiating into oligodendrocyte.【Key words】 acupuncture and moxibustion therapy; neural stem cells; differentiation; glial cell; olf

ctory bulb

在近年来的机理研究中发现，针灸刺激可以促进室管膜下层、中枢病灶周围及海马的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)增殖[19]。嗅球是NSCs增殖分化的脑区之一[10],我们的研究已经表明针灸刺激也可促进嗅球NSCs增殖和向神经元分化(另文发表)，但针灸刺激能否影响嗅球NSCs向胶质细胞分化呢?本实验做了进一步的探讨，现将结果报告如下。 1 材料与方法

1.1 实验动物及分组雄性快速老化小鼠(SAMP8) 38只，8月龄，体重20～24 g.经体重筛选后，分为快速老化组(简称P8组)、针刺治疗组(简称Acu组)和艾灸治疗组(简称Mox组)，每组10只。另以10只雄性正常老化小鼠(SAMR1)作为对照(简称R1组)，8月龄，体重20～24 g.动物购自天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心(清洁级，合格证号：WJ津实动质M准字第006号)。自由进食、饮水，光照∶黑暗=12∶12.动物房温度、湿度分别维持在26℃、70%左右。

1.2 主要试剂和材料5溴2脱氧尿苷(5bromo2deoxyuridine，BrdU)购于Sigma公司;BrdU、Nestin、MAP2一抗购于santa cruz;betaTubulin Ⅲ购于Abcam;华佗牌针灸针(规格：0.19 mm×10 mm)、艾绒购于苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 动物处理于小鼠头顶两耳根连线中点(顶骨正中)取督脉之“百会”穴。针刺操作：小鼠固定后，持针灸针向前平刺约2 mm，进针之后，行捻转手法操作约10 s，频率约150次/min，每隔5 min行针1次，每次治疗20 min.艾灸操作：小鼠固定后，用镊子持艾炷施灸，

每次3壮。针刺、艾灸均每日1次，7次为1疗程，共治疗3个疗程，疗程间休息2 d.对照组和模型组：除不予针刺或者艾灸治疗外，其他处理方式与针刺组、艾灸组相同。

1.4 BrdU注射在动物处死前1 周，给予小鼠腹腔注射BrdU，50 mg/kg，每天1次，连续注射7 d.

1.5 取材在第7次BrdU腹腔注射后的第2 d，心脏灌注固定后取出嗅球固定、冰冻切片，切片厚度8 μm.

1.6 NSCs向胶质细胞分化检测采用免疫荧光双标进行NSCs向胶质细胞分化检测。其中BrdU/ S100 β鉴定星形胶质细胞、BrdU/GALC鉴定少突胶质细胞。检测步骤参照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理免疫荧光双标染色阳性细胞数以均数±标准差(±s)表示。采用SPSS 15.0统计软件包进行单因素方差分析(One WayANOVA)、q检验(Newankeuls法)，P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果

BrdU的特性不仅能掺入到增殖或分裂细胞的核内，还能长期停留在分化细胞和子代细胞中。利用BrdU的这一特性结合相应的细胞分化标记物进行免疫荧光双标技术检测，即可追踪NSCs增殖后的迁移、存活和分化等;S100 β是星形胶质细胞的标记物、GALC是少突胶质细胞标记物。因此，我们分别采用BrdU/S100 β、BrdU/GALC荧光双标鉴定NSCs是否分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞。实验结果显示，正常老化小鼠嗅球NSCs可分别向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，快速老化小鼠向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化更显著于正常老化组小鼠(P<0.05，P<0.01)(见表1及图1、2)。针刺组向星形胶质细胞分化的阳性细胞数与快速老化小鼠比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但向少突胶质细胞分化的阳性细胞数与快速老化小鼠比较，差异没有统计学意义(P>0.05);艾灸组向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的阳性细胞数与快速老化小鼠比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示艾灸可能能抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，但针刺刺激主要是抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞分化，而对向少突胶质细胞分化抑制作用不明显。表1 嗅球NSCs向胶质细胞分化的结果(阳性细胞数 3 讨论

成年后NSCs向胶质细胞方向分化, 是脑内神经发生现象发现以来的重要研究内容[11]。神经营养因子、丰富环境刺激、激素、学习、记忆、训练、脑缺血、外伤、运动、年龄等多种因素均能影响脑内NSCs的增殖分化，促进神经发生[1215]。在本实验中，无论是正常老化小鼠还是快速老化小鼠，均有嗅球NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的现象，但快速老化小鼠增殖数目多于正常老化小鼠，提示老化可能是一种促进NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的因素[1618], 从而减少了NSCs向神经元方向的分化。胶质细胞的功能主要是支持、营养、促进神经元修复等作用。神经元主要是感受刺激和传导兴奋,结合本实验结果,我们认为,在快速老化病理状态下NSCs大量向胶质细胞分化,可能是一种对机体神经元减少的替代或补救措施。通过针刺、艾灸治疗后，我们发现，艾灸可能抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，但针刺刺激主要是抑制SAMP8小鼠嗅球NSCs向星形胶质细胞分化，而对向少突胶质细胞分化抑制作用不明显。这有可能是针灸抑制NSCs向胶质细胞分化，从而诱导NSCs向神经元分化，并以新生神经元发挥对机体受损神经元的替代作用。另外，针刺和艾灸是针灸疗法中两种不同的刺激方式，古有“针所不为，灸之所宜”的叙述，即针刺、艾灸可能各有所长。我们认为，针刺对机体产生的是机

械力学刺激、艾灸对机体产生的温热刺激，并分别通过痛觉通路、温度觉通路向上传导至中枢产生作用。本次实验选择的穴位位于头部，头面部的痛、温觉传导通路均是通过头面部皮肤及口鼻腔粘膜的有关感受器→三叉神经节细胞(第1级神经元)→三叉神经根入脑桥→三叉神经脊束, 止于三叉神经脊束核(第2级神经元)→发出纤维交叉到对侧→组成三叉丘系→止于丘脑(第3级神经元)→发出纤维经内囊→中央后回，这可能提示，针刺、艾灸的痛温觉刺激作为一种物理刺激方式，能抑制嗅球NSCs向星形胶质细胞分化;但艾灸疗法除了温热刺激外，艾绒在燃烧时，还会释放出艾烟以及一些挥发油等成分，我们推测，可能是释放出来的艾烟以及挥发油等成分通过嗅觉通路的影响，从而还能抑制嗅球NSCs向少突胶质细胞分化，可能这正是针刺、艾灸两种不同刺激方式的异同所在。是否如此，有待进一步研究证实。 【参考文献】

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