植物基因克隆的方法

国土与自然资源研究　２０１５　Ｎ０．３　ＴＥＲＲＩＴＯＲＹ＆ＮＡＴＵＲＡＬ　ＲＥＳＯＵＲＣＥＳ　ＳＴＵＤＹ　・９１・　文章编号：１００３—７８５３（２０１５）０３—００９１—０３　的基因组序列。自２０００年，第一个模式高等植物拟南　基金项目：ＣＯ：倍增条件下之三江平原小叶章光合蛋白分析及　芥的全基因组公布之后［１】，陆续完成了水稻、番茄、土　相关基因功能验证研究　豆、大豆、玉米、葡萄、杨树、柑橘、白菜等全基因组的　测序。随着Ｒｏｃｈｅ（４５４）一ＧＳＦＬＸ　ｓｅｑｕｅｃｅｒ，Ｉｌｌｕｍｉｕａ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓ０ｌｅｘａ），ＨｅｌｉＳｃ叩ｅｓｅｑｕｎｃｅｒ第二代测序　平台的推出，高通量ＥＳＴ测序在校正基因注释方面的　植物基因克隆的方法　作用越来越大，为后基因组学研究提供了大量的基因　组数据库的便利条件。因此，基因研究的热点从基因　王丽媛，徐明怡，倪红伟　，　　‘测序转移到基因功能、表达、调控的研究，基因克隆成　张玉，冷海南　为核心的研究内容。与此同时，许多植物高密度分子　（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育　标记、连锁图谱的构建，大片段ＤＮＡ克隆系统的建立　国家地方联合工程实验室，哈尔滨１５００４０）　也为未知基因的克隆奠定基础，分离控制重要性状的　摘要：基因克隆技术是挖掘新基因、分离控制植物重要性状基　主效基因成为基因克隆的核心内容。植物与人类生活　因的有效手段。随着拟南芥、番茄、杨树等植物全基因组测序的　息息相关，其生命活动受基因时空表达控制，因此分　完成，标志着植物基因组的研究进入到了后基因组的时代，研　离植物中有应用价值的基因并进行深入研究，对了解　究植物基因功能、表达、调控成为今后研究的热点，因此基因克　植物本身、遗传改良具有十分重要的意义。本文针对　隆技术应用将更加广泛。本文主要介绍了图位克隆、转座子标　目前常用的克隆技术进行了归纳总结。　签克隆、同源克隆、表达序列标签等植物基因克隆的方法，并对　其原理、应用及研究进展做了简单阐述。　１图位克隆克隆技术　关键词：图位克隆；转座子标签克隆；同源克隆；表达序列标签　图位克隆【２］（ｍａｐ—ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）又称定位克隆（ｐ０一　中图分类号：Ｑ７８　文献标识码：Ａ　ｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ），常用语分离功能性状的基因。图位克　Ｔｈｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　隆技术是由剑桥大学的Ａｌａｎ　Ｃｏｕｌｓｏｎ在１９８６年提出　的。功能基因在染色体上都有特定的位置，所以利用　ＷＡＮＧ　Ｌｉ－ｙｕａｎ　ｅｔ　ａｌ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，ＨＡＳ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　图位克隆的技术分离目的基因无需知道ＤＮＡ序列，找　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｊｏｉｎｔ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｗｅｔｌａｎｄｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　到与目的基因紧密连锁的基因分子标记，利用与目的　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｃｈｉｎａ）　基因紧密连锁的分子标记在含有大插入片段的基因组　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｈｉｃｈ　文库（ＢＡＣ、ＹＡＣ・ＴＡＣ或Ｃｏｓｍｉｄ）中进行筛选，从而构　ｃａｎ　ｍｉｎｅ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｉｍｐ＆－　建目的基因区域的物理图谱，再利用染色体步查　ｒａｎｔ　ｔｒａｉｔ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．Ａｌｏｎｇ　ｗｉｔｈ　ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ，　（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗａｌｋｉｎｇ）或通过染色体登陆翻（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｔｏｍａｔｏ，ｐｏｐｌａｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ，ｉｔ　ｍａｒｋｅｄ　ｌａｎｄｉｎｇ）等技术，找到包含该目的基因的克隆，并通过　ｈｔａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｈａｖｅ　ｅｎｔｅｒｅｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｔ－ｇｅｎｏｍｉｅｓ　遗传转化试验证实目的基因的功能。随着分子生物学　ｅｒａ．Ｒｅｓｅｒｃｈｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｈａｖｅ　技术的发展，图为克隆技术在模式植物、农作物等植　ｂｅｃａｍｅ　ａ　ｈｏｔ　ｓｐｏｔ　ｏｆ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．Ｓｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｍｏｒｅ　ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ．Ｔｉｓｈ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｍａｉｎｌｙ　ｉｎｍ—　物功能基因克隆中应用非常广泛［４１。首次应用是在　ｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ａｐｐｈｃａｆｉｏｎ，ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｃｅｓ　ｏｆ　ｍａｐ—　１９９２年，由Ｇｉａｎｄａｔ　Ｊ和Ａｒｏｎｄｅｌ　Ｖ．等人在拟南芥中分　ｂａｓｅｅｌｏｎｇｉｎｇ，ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｔａｇｇｉｎｇ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ—ｂａｓｅｄ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅ　别成功分离了ＡＢＩ３基因和ＦＡＰ３基因，随后Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ，ｅｓｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．　Ｂｍ等人又成功克隆了果实发育模式植物番茄等一个　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍａｐ—ｂａｓｅｃｌｏｎ￣ｎｇ；ｔｒｎａｓｐｏｓｏｎ　ｔａｇｇｉｎｇ；　抗病相关基因Ｐｎ【　。由于抗性基因的遗传行为比较简　ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ；　单而且抗性性状表型比较容易稳定，所以自１９９２年以　ｅｓｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　后１０年的时间里，图位克隆技术多针对抗原（真菌、　细菌、病毒、害虫）的抗性基因（Ｒ基因）的克隆。如，拟　人类基因组计划（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｉｅｃｔ，ＨＧＰ）从　南芥中的ＣＯｌ　Ｉ、ＮＰＲ　Ｉ、ＢＫＩＩ等基因。番茄中的Ｐｔｏ．　１９９０年正式实施开始，在美国、英国、法国、德国、日本　Ｆｅｎ．ＲｉｇＭｉ。水稻Ｘａ２　Ｉ．ＸａＩ，Ｐｉ—ｂ，ＤＩ。大麦中的Ｍ０ｌ，　和中国科学家的共同努力下，２０００年人类基因组草图　Ｃｎｅ３，甜菜Ｈｓｐｒｏ—Ｉ基因等。在植物各种分子标记的　绘制基本完成，使得大规模ＤＮＡ测序成为一种常规　不断丰富，植物基因组数据库不断完善的前提下，图　研究手段。在ＤＮＡ测序技术不断发展完善背景下，科　位克隆技术不但应用在功能性状的基因克隆上，还逐　学家们开始研究一些模式植物、农作物、树木等植物　步应用在数量性状的基因上。如，水稻的ＳＫＣＩ基因［６１，　王丽嫒等植物基因克隆的方法　锌指蛋白转录因子ＤＳＴｔ　；拟南芥中的耐盐相关基因　在绝大多数植物中，抗病基因编码的蛋白质具有一定　ＲＳＡ／ｓ１，拟南芥中编码类似几丁质酶的蛋白质ＣＴＬ１ＤＥ　的同源性，这些蛋白质具有相同的结构域，如核苷酸　ｈｏｔ２基因［９１，以及水稻中编码分蘖矮杆基因ｈｗ－ｌ（ｔ）㈣，　结合位点（ＮＢＳ）、丝氨酸一苏氨酸激酶（ＳＴＫ）、亮氨酸　编码丝氨酸羟甲基转移酶的ＳＨＭＴ１基因［１１３；大麦中　拉链（Ｌ２）、跨膜结构域（ＴＭ）富亮氨酸重复序列（ＬＲＲ）　的ＳＯＳ３同族体ＨｖＮａｘ４基因等【１２】。　等，这些结构域具有高度保守性，利用编码这些结构　通过图位克隆技术获得了大量的功能性基因，但　域的同源基因序列设计简并引物，获得抗病基因同源　是它也有一定的局限性。图为克隆成功有两个先决条　序列（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ａｎａｌｏｇｓ，ＲＧＡＳ），再利用ＲＡＣＥ技　件：一是具有构建完整的基因组文库；二是具有与目　术获得基因全长，通过定量ＰＣＲ方法，研究基因的表　标基因紧密连锁的分子标记。所以对于像水稻、拟南　芥、小麦等全基因组测序完成的植物而言，图为克隆　技术应用的更为成功。此外，有些基因组较大的植物　基因组中，重复序列多、基因容量大、遗传转化体系不　成熟等因素，极大的限制了遗传连锁或者物理图谱的　构建，使得图位克隆技术在这类植物中应用较慢。图　位克隆技术虽然有一定的局限性，但是它仍是克隆植　物功能性基因的有效方法。　２转座子标签克隆技术　转座子（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ），又称转座元件（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ，ＴＥ）它是生物染色体上一段可以从一个基因　座位转移到另一个基因座位的ＤＮＡ序列，转座子的　插入或缺失都会引起其相邻基因的表型突变。　转座子最初是在玉米种发现的，美国遗传学家　Ｍｃｌｉｎｔｏｃｋ在研究玉米籽粒色斑不稳定时提出的这一　现象。转座子标签法克隆基因的原理正是基于转座子　序列的特性进行的。由于转座子是可以移动的，当转　座子插入到目标基因内部或邻近位点时，会使插入基　因失活，从而引起变型上的突变，利用引起突变的转　座子ＤＮＡ序列作为探针，从突变株的基因组文库中　筛选出带有该转座子的ＤＮＡ序列，再将筛选出的含　有突变株ＤＮＡ序列座位探针，筛选野生型植株的基　因组文，最终获得目的基因。转座子的类型非常丰富，　在植物基因克隆中应用最多的是玉米的ＡｓｋＤｓ转座子　系统、Ｍｕｔａｔｏｒ、ＥｎｋＳｐｍ等转座子系统，除此以外还有家　蝉中的ＭＩＴＥ系统，ｈＡＴ、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ、金鱼草Ｔａｍ３等。　目前，已报道很多未知功能的基因通过转座子标　签法克隆出来。以玉米Ａｓ￣Ｄｓ系统为例，在内源基因　方面成功克隆了玉米中的ＴＭ２０，Ｔｓ２，ＰＳ１等基因，在　拟南芥中，ＡｆｌｒｇＢ，ＣＡＯ，ＳＳＴＩ６，ＤＴＬ１基因等；大麦中　的Ｕｒｏｓ，水稻中的ＲＩＮＧ—ＨＺ，ＯｓＫＤＩ等。随着人们对　转座子元件的开发，转座子系统的深入研究，对转座　子标签操作技术的精准和熟练，在将来会挖掘出更多　未知基因的功能；在研究植物基因组的功能、基因组　的组成植物系统发育等很多方面发挥重要作用。　３同源克隆　同源克隆技术是植物抗病基因克隆常用的手段。　达，鉴定该基因的功能。目前科学家门利用同源克隆　技术已经克隆出了大量的抗病基因。例如马铃薯中的　Ｒｘ２、Ｇｒｏｌ一４基因，小麦［１３】的抗也锈病基因Ｌｒｌｄ、拟南芥　抗病基因ｅｌＦ４Ｅ，目前科学家们已经从２０多种生物中　克隆出抗病基因同源序列。同源克隆法不仅应用在抗　病基因克隆的方面，在植物抗逆性基因方面应用也非　常广泛。例如张广科等人利用同源克隆法成功克隆了　葡萄抗逆基因ＶｖＢＡＰ１【Ｈ】，实时荧光定量ＰＣＲ推测　ＶｖＢＡＰ１基因参与葡萄抵御低温和盐胁迫的过程。同　源克隆方法获得的是同源序列与植物的基因仍有较大　区别，由于植物中有一些蛋白也会含有ＬＲＲ或ＮＢＳ　结构域，所以通过该方法获得的基因需要进一步验　证。　４表达序列标签法　表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ，ＥＳＴｓ）这一　概念是在１９９１年由Ａｄａｍｓ［　首次提出的，是一段表达　基因的部分序列，从一个随机选择的ｅＤＮＡ克隆进行　５　端和３　端单一次测序获得短的ｃＤＮＡ部分序列，在　数据库中其长度一般从２０—７００ｂｐ不等，平均长度为　３６０＋２０ｂｐ。ＥＳＴ其所在表达基因中特异性的序列，每　ＥＳＴ都包含了表达的该基因有足够结构信息，编码的　ＤＮＡ具有高度保守性，因此ＥＳＴ做为一种分子标记，　在制作基因组连锁、比较质量性状信息上非常有效。　ＥＳＴ来自一定组织一定环境下，总ｍＲＮＡ所构建的　ｅＤＮＡ文库，ＥＳＴ可以反映生物体内基因表达情况的丰　度。因此人们越来也重视ＥＳＴ的发展，建立了大量的　ＥＳＴ数据库，这为克隆新基因，提供了有效方法，并且　ＥＳＴ也成为发现新基因的主要途径　】。　ＥＳＴ克隆基因的主要策咯，首先应先构建某个组　织的ｅＤＮＡ文库，针对已知序列进行数据库分析，找出　代表新基因的ＥＳＴ的相关信息，制备探针；利用设计好　的探针在ｅＤＮＡ库中随机筛选大量克隆，设计通用引　物，与ｅＤＮＡ阳性克隆进行巢式ＰＣＲ和５　，３　ＲＡＣＥ，　一般能得到５　端和３　端的２００—５００ｂｐ的碱基序列，经　过测序后，将所得的ＥｓＴ序列与已有的ＥＳＴ数据进行　比对分析，拼接延伸，ＯＲＦ识别，结构分析，翻译蛋白　质分析。最后鉴定出ＥＳＴ所代表的新基因，并可以进　王丽媛等植物基因克隆的方法　一・９３・　９】　Ｍｏｒｅｎｏ　Ｊ．Ｉ．，　ＭｅａｒｔｉｎＲ．，ｎｄＣａａｓｔｒｅｓｎａ　Ｃ，ａ　２００５，　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　步分析该基因的表达丰度【　。ＥＳＴ刚刚兴起时，由构　【ａ　ｓｅｒｉｖｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌ　ｔｒｎｓｆａｅｒａｓｅ　ｔｈａｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　建ｃＤＮＡ文库和测序技术还不够完善，ＥＳＴ的测序较　ＳＨＭＴ１，ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｐａｔｈ　ｗａｙ　ｒｒｄｌｕｅｎｃｅｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｂｉｏｔｉｃ　ａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｅ　低，测序覆盖度也非常低，ＥＳＴ在最初建立时，应用并　ｓｔｒｅｓｓ，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，４１（３）：４５１－４６３．　不广泛。随着边合成边测序（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｒ　［１０］郭涛，黄勇组，黄宜，等．水稻叶色白化转录及多分孽矮杆　ｌｉｇａｔｉｏｎ）为标志的第二代测序的彭博发展，使得ＤＮＡ　基因ｈｗ一１（ｔ）的图为克隆．作物学报，２０１２，３８（８）：１３９７～１４０６．　测序技术的成本大大降低，ｃＤＮＡ文库的大规模测序　【１　１］Ｒｉｒｎｄｉａ　Ａ．，２００９，Ｔｏｗａｒｄ　ｍａｐ—ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　Ｎａ＋ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｒｏｍ　ｂａｒｌｙ（Ｈｏｒｄｅｔｕｍｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．），Ｔｈｅｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｍ．Ｓ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　已成为一项实用技术。如此高通量的ＥＳＴ测序将加快　ｇｅｎｅ　ｆ表达基因的克隆效率Ｈ　。　５小结　植物功能基因组学的研究落后于人类，微生物、　病毒等【ｌ９ｊ。微生物、病毒与人类的生活息息相关，对人　类基因组的研究会对人类的健康做出巨大的贡献，所　以在这些方面投入的人力，物力也更多。随着ＤＮＡ测　序技术的发展，可以在低成本低人工的条件下获得植　物的基因组，建立了大量植物基因组数据库，为后基　因组学的研究提供了前提条件。植物的各种生命性　状，是受基因时空表达调控，分离相关的抗病、抗旱、　抗害等相关功能基因，并进行深入的研究，对改良植　物本身的性状具有重要意义。所以上述几种克隆方法　在植物基因克隆方面具有广阔的应用前景，但对于科　研人员来讲，应从实际工作出发合理的选择，并不断　改进和创新，才能有效的分离目的基因。　参考文献：　［１］ＥＣＫＥＲ　ＳＲ．’Ｉ’ＨＥＯＩ　）ＳＩＳＡ．ＦＥＤＥＲＳＰＯＥＬ．ＮＡ，ｅｔａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｙｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｆｌｗｅｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ【Ｊ】．　Ｎａｔｕｒｅ，２０００．４０８（６８）４：７９６～８１５．　［２】Ｃｏ￣ｓｏｎＡ，ＳｕｌｓｔｏｎＪ，Ｂｍｎｅ￣，ｅｔ１ａ．Ｔｏｗａｒｄ　ａ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｐｍａｔｏｄｅＣａｅｎｏｒｈｏｂｄｉｔｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ．１９８６．８３（２Ｏ）：　７８２１￣７８５２．　【３】Ｔａｎｋｓｌｅｙ　Ｓ．Ｄ．，ＧａｎａｌＭ．Ｗ．，Ｍａｒｔｉｎ　Ｇ．Ｂ．．Ｃｈｏｍｏｓｏｍｅｌａｎｄｉｎｇ：Ａ　ｐａｒａｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍａｒｐ－ｂａｓｅｄ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｌｒａｇｅ　ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．　Ｔｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ，１９９５（１　１）：６３￣６８．　【４】ＧｉｒａｕｄａｔＪ，Ｈａｕｇ　Ｂ．Ｍ．，ＶａｌｃｏＬ，ＳｍａｌｌＪ．，ＰａｒｃｙＦ．，ａｎｄ　ＧｏｏｄｍａｎＨＭ，　１９９２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＢ１３　ｇｅｎｅ　ｂｙ　ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，４（１０）：１２５１￣１２６１．　［５】ＧｒｅｇｏｒｙＢＭ，ＢｒｏｍｎｍｏｎｃｃｅｎｋｅｌＳＨ，ＣｈｕｍｗｏｎｇｅｓＪ，ｅｔ１ａ．Ｍａｐ－ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｃｅ，１９９３（２６２）：１４３２￣１４３６．　【６】　ＲｅｎＺ．Ｈ，ＧａｏＪ…Ｐ　Ｈ　Ｌ．Ｇ．，ＣａｉＸ．Ｌ．；ＨｕａｎｇＷ．，ＣｈａｏＤ．Ｙ．，ＺｈｕＭ．Ｚ．，　Ｗ丑Ｊ１ｇｚ．Ｙ．，ＬｕａｎＳ，ａｎｄ　ＬｉｎＨ．Ｘ．，２００５，Ａ　ｒｉｃｅ　ｑｕａｎｔｉａｔｔｉｖｅ　ｔｒａｉｔ　ｌｏｃｕｓ　ｆｏｒ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｓｏｄｉｕｍ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７　（１Ｏ）：１　１４１－１　１４６．　【７】ＨｕａｎｇＸＹ，ＣｈａｏＤＹ，Ｇ｛ｌｏＪＰ，ＺｈｕＭＺ，ＳｈｉＭ．，ａｎｄ　ＬｉｎＨ．Ｘ．，２００９，Ａ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＳＴ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｒｏｕｇｈｔ，ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｖｉａ　ｓｔｏｍａｔａｌ　ａｐｅｒｔｕｒｅ　ｃｏｎｔｒ．　【８】Ｇｕａｎ　Ｑ．Ｍ．，ＷｕＪ．Ｍ．，Ｙｕｅｘ…Ｌ　ＺｈａｒｌｓＹ．Ｙ．，ａｎｄ　Ｚｈｕ　Ｊ．Ｈ．，２０１３，　Ａｍｕｃｌｅａｒ　ｃａｌｃｉｕｍ—ｓｅｎｓｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｓ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｓｌ￣ｅｓｓ　ｔｏｌｅｒｎａｃｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｌＰｏｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９（８）：ｅ１００３７５５．　ＷｓｅｔｅｍＳｙｄｎｅｙ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ　Ｎｉｃｋ　Ｃ，ｎａｄ　ＧｌｅｎｎＭ，ＰＰ．１－３５．　［１２】Ａｄａｍｓ　ＭＤ，ＫｅＵｙＪＭ，ＧｏｃａｙｎｅＪＤ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｅｉｎｇ：ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｅａｇｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｐｒｏｊｅｃｔ［Ｊ】．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：１６５１．　【１３］Ｋｗｏｎ　Ｙ…Ｒ　ＫｉｍＳ．Ｈ．，ＪｕｎｇＭ…Ｓ　Ｋｉｍ　Ｍ…Ｓ　Ｏｈ．Ｊ．Ｅ．，ＪｕＨ．Ｗ．，Ｋｉｍ　Ｋ．Ｉ．，Ｖｉｅｒｌｉｎｇ　Ｅ．，ＬｅｅＨ．，ｎａｄ　Ｈｏｎｇ　Ｓ．Ｗ．，２００７，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｈｏｔ２　ｅｎ—　ｃｅｄｅｓ　ａｎ　ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｅｓｓｅｎｔｉｌａ　ｆｏｒ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｈｅａｔ，ｓａｌｔ　ｎａｄ　ｄｍｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ，Ｐｌａｎｔ　Ｓ．，４９（２）：１８４－１９３．　［１４】张广科，肖培连，侯丽霞，王文杰，马倩，刘新．葡萄ＶｖＢＡＰ１　基因的克隆及表达特性分析［Ｊ】．植物生理学报，２０１４（０６）：　８２９－８３４．　［１５】Ａｄａｍｓ　ＭＤ，ＫｅｌｌｙＪＭ，ＧｏｃａｙｎｅＪＤ，ｅｔ１ａ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｅｘｐｒｅｓｓｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｅａｇｓ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ　ｐｒｏｊｅｃｔ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１（２５２）：１６５１．　【ｌ６】洪林，程昌凤，魏文辉，陈霞，谭平．高等植物基因克隆的策　略【Ｊ］．浙江农业学报，２０１３（Ｏ４）：９１４－９２０．　［１７］李少锋，苏晓华，张冰玉．林木基因克隆研究进展［Ｊ］．植物　学报，２０１１（Ｏ１）：７９～１０７．　［１８】尹佟明．林木基因组及功能基因克隆研究概述【Ｊ］．遗传，　２０１０（０７）：６７７—６８４．　【１９］张广科，肖培连，侯丽霞，王文杰，马倩，刘新．葡萄ＶｖＢＡＰ１　基因的克隆及表达特性分析［Ｊ］．植物生理学报，２０１４（０６）：　８２９－８３４．　作者简介：王丽媛，毕业于哈尔滨师范大学。硕士学历。生物化　学与分子生物学专业。　通讯作者：倪红伟。　（２０１５—０５—２７收稿刘晓佳编辑）　《国土与自然资源研究》期刊征稿　《国土与自然资源研究》是由黑龙江省科学院自然与生态　研究所主办的综合性学术期刊，已经有３Ｏ多年的办刊历史，集　学术性、实用性、权威性、前瞻性与专业性于一体，面向国内外　公开发行，为广大教育、科研工作者提供学术交流平台。　《国土与自然资源研究》国内统一刊号：ＣＮ２３—１２１６／Ｎ，邮　发代号：１４—１２５，国外发行代号：Ｑ５７７６。现面向广大科研工作　者常年征稿，欢迎各类大中专院校和科研院所专家、学者、教　师、学生等踊跃投稿。　征稿范围：区域经济、城乡建设、土地利用、农业可持续发　展、环境质量评价、生态安全、旅游资源开发、动植物保护与利　用等。