CyclinD1反义寡核苷酸对胃癌细胞化疗敏感性的影响

2005年第17卷第4期

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CyclinD1反义寡核苷酸对胃癌细胞化疗敏感性的影响

帅晓明,韩高雄,陈俊安,王国斌　(华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科,武汉　430022)

摘　要:　目的　研究CyclinD1反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞SGC27901和HS2746T化疗敏感性的影响,并探讨其内在机制。方法　在给予CyclinD1ASODN和CyclinD1反义寡核苷酸转染细胞24h后,分别给予梯度浓度的52氟尿嘧啶(52FU)、氨甲喋呤

(MTX)、顺铂(CDDP),观察各组的量效反应,计算IC50。CyclinD1ASODN转染细胞后24h、48h时应用RT2PCR分别检测各组细胞中

胸苷酸合酶(TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶(TP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达情况。结果　CyclinD1ASODN转染增加了两种胃癌细胞对52FU、MTX、CDDP的敏感性,ASODN+化疗组对各化疗药物的IC50与对照组相比均有显著下降。RT2PCR显示CyclinD1ASODN转染后24h时CyclinD1、TS、DHFRmRNA表达较对照组下降,而TPmRNA表达较对照组升高,在48h时各种酶mRNA表达的改变更加明显。结论　CyclinD1ASODN能提高胃癌细胞对多种化疗药物的敏感性,可能是由于影响了化疗药物代谢相关酶表达的改变所致。关键词:　胃癌;　CyclinD1;　反义寡核苷酸;　化疗敏感性[中图分类号]R73512　[文献标志码]A　[文章编号]10052541X(2005)042155204EffectsofCyclinD1AntisenseOligodeoxyneucleotidesonChemosensitivityofGastricCarcinomaCells

SHUAIXiao2ming,HANGao2xiong,CHENGJun2hua,WANGGuo2bin

DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Abstract:　Objectives　ToexaminetheeffectofCyclinD1antisenseoligodeoxyneucleotides(ASODN)onchemosensitivityofgastriccarci2nomacelllinesSGC27901andHS2746T.Methods　52FU,MTX,CDDPindifferentconcentrationsweregiventoeverygroupaftertransfectedwithCyclinD1SONDorASODNfor24h,thedose2effectsresponsewasobservedandIC50wascalculatedineverygroup.ThemRNAexpressionsofCy2clinD1,ThymidylateSynthase(TS),ThymidinePhosphorylase(TP),DihydrofolateReductase(DHFR)weredetectedbyreversetranscription2PCR(RT2PCR)ineverygroupat24hand48haftertransfection.Results　CyclinD1ASODNcouldincreasethesensitivityto52FU,MTX,CD2DPinthetwogastriccarcinomacelllines.TheIC50ofdifferentchemotherapeuticagentsinASOON+chemotherapygroupsweresignificantlylowerthanthoseinchemotherapygroups.RT2PCRshowedthattranfectionwithCyclinD1ASODNleadtoadecreaseinCyclinD1,TSandDHFRmRNAandanincreaseinTPmRNAasdeterminedbyRT2PCRat24h,thealterationsweremoresignificantat48h.Conclusion　CyclinD1canenhancethechemosensitivitytomultiplechemotherapeuticagentsingastriccarcinomacells,andthiseffectmaybeduetothealteredexpressionofenzymesrelatedtometabolismofchemotherapeuticagents.

Keywords:　Gastriccarcinoma;　CyclinD1;　Antisenseoligodexoyneucleotides;　Chemosensitivity

　　胃癌对化疗中度敏感,单药化疗常不能取得理想的效果,如52氟脲嘧啶或顺铂单用对胃癌的有效率只有20%左右。在研究中我们发现,CyclinD1反义寡核苷酸(ASODN)能有效地抑制SGC27901和HS2746T等两种胃癌细胞的生长,为进一步研究CyclinD1ASODN的作用,我们检测了它与传统化疗药物52氟尿嘧啶(52FU)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(CDDP)联合对胃癌细胞的杀伤作用,并研究了CyclinD1ASODN对52FU、MTX代谢相关酶表达的影响,包括胸苷酸合酶(TS)、胸腺嘧啶磷酸化酶(TP)、二氢叶酸还原酶(DHFR),进一步明确其中的机制,以便将传统化疗与基因治疗结合起来,寻找更为有效、低毒性的联合化疗方案。材料和方法

111　试剂　CyclinD1反义寡核苷酸5’2GGAGCT

(ASODN),与CyclinD1cDNAGGTGTTCCATGG23’

翻译起始位点互补,以正义链5’2CCATGGAACACC

(SODN)作为对照[1],采用全硫代修饰,AGCTCC23’由上海申工生物技术公司合成。ODN冻干粉用无菌

水溶解,使其浓度为25μmol/L,0122μm微孔滤膜过滤除菌,-20℃储存备用。

LipofectAMINE2000(LF2000)购自Invitrogen公司。LF20002ODN复合物的制备参照说明书,用无血清培养基分别稀释LF2000和ODN,按比例混合。室温孵育30min。转染时用无血清培养基稀释成所需的浓度。52FU、MTX、CDDP均购自Sigma公司。112　细胞培养和分组　SGC7901由第四军医大学西

京医院消化疾病研究所樊代明教授惠赠。HS746T购自武汉大学典型培养物保藏中心。采用含100ml/L小牛血清的DMEM培养基(GIBCOBRL),于37℃,5%CO2培养。按处理方法不同分为3组:(1)单纯化疗

组,给予不同浓度的化疗药物处理。(2)SOND+化疗

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组,给予012μmol/LCyclinD1SODN转染24h后,再给予不同浓度的化疗药物处理。(3)ASODN+化疗组,给予012μmol/LCyclinD1ASODN转染24h后,再给不同浓度化疗药物处理。

113　CyclinD1ASODN不同化疗药物的联合作用　细胞接种于96孔培养板,贴壁后,分别加入012μmol/L的ASODN、SODN与LF2000的复合物。转染24h后,更换为含有梯度浓度的化疗药物的培养基继续培养72h。弃去培养上清,每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃孵育4h,加入DMSO,各100μl,充分振荡并放置15min。将样本置酶标仪测定490nm波长的吸光度值(A490),计算存活率,绘制量效曲线。采　临床消化病杂志

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用GraphPad公司的Prism3软件计算各个化疗药物

的IC50。

114　RT2PCR　细胞接种于96孔培养板,设立空白对照组和正义对照组,按上述方法转染并培养。于转染后24h和48h时收获转染细胞,Trizol(GIBCO)提取总RNA。取1μgRNA用于逆转录,20μl反应体系包括Oligo(dT)011μg、2mmol/LdNTPs4μl、Rnasin011μg和MMLV200u。反应条件42℃1h,95℃5min。215μl逆转录产物用于PCR,40μl反应体系加入dNTPs,上、下游引物各100pmol,Taq酶。采用G3PDH作为参照。11411　引物设计　见表1。

表1　引物设计

引物序列

CyclinD1

5’2GGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAAC23’5’2GAGAGGAAGCGTGTGAGGCGGTAG23’

TS

5’2CACACTTTGGGACATGCACATATTT23’5’2CTTTGAAAGCACCCTAAACAGCCAT23’

TP

5’2ACAAGGTCAGCCTGGTCCTC23’5’2TCCGAACTTAACGTCCACCAC23’

DHFR

5’2TCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTT23’5’2CACAAATAGTTTAAGATGGCCTGGG23’

G3PDH

5’2TCCCTCAAGATTGTCAGCAA23’5’2AGATCCTCAACGGATACATT23’

扩增片段长度

514bp(332bp～845bp)

208bp(853bp～1060bp)

353bp(491bp～834bp)

231bp(657bp～887bp)

309bp

11412　反应体系及循环过程　各反应管94℃变性5min,分别按下列条件进行35个循环:CyclinD1,94℃60s→65℃115min→72℃115min;TS,94℃30s→55℃30s→72℃30s;TP,94℃30s→60℃30s→72℃30s;DHFR,94℃30s→60℃30s→72℃30s;G3PDH,94℃30s→54℃30s→72℃30s。

RT2PCR产物(CyclinD1:514bp,TS:208bp,TP:353bp,DHFR:231bp,GAPDH:309bp)经2%琼脂糖

在两种胃癌细胞中CyclinD1ASODN转染后24h能显著增加52FU、MTX、CDDP的细胞毒性。ASODN+化疗组对各化疗药物的IC50明显低于单纯化疗组和SODN+化疗组。SGC27901和HS2746T细胞对不同

处理的IC50见表1。

6表2　各组细胞对52FU、MTX、CDDP的IC50(×10mol/L)

52FU

SGC27901

MTXCDDP

凝胶电泳,EB染色,通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带分析。各产物与G3PDH丰度的比值作为表达水平的参数。对mRNA表达进行相对定量。

115　统计学处理　结果用x󰁡±s差表示,采用t检验进行统计学分析。P<0105为差异有显著性。2　结　　果

211　CyclinD1ASODN增加SGC27901细胞的化疗敏

单纯化疗组

SODN+化疗组ASODN+化疗组HS2746T

3195±01924143±01410198±01153

△

1127±01321125±01100138±01043

△

2112±01221188±01070152±01073

△

单纯化疗组

SODN+化疗组ASODN+化疗组

2180±01872146±01430184±01053

△

2163±01132140±01360159±01083

△

5144±01515147±01631113±01123

△

△

　　3与单纯化疗组相比P<0105。与SODN+化疗组相比P<0105。

212　CyclinD1ASODN对CyclinD1和化疗药物代谢

感性　在CyclinD1SODN和CyclinD1ASODN转染

细胞后,分别给予不同浓度的52FU、MTX、CDDP,发现

相关酶mRNA表达的影响　发现经CyclinD1ASODN转染24h后,在两种胃癌细胞中都发现了CyclinD1、

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　临床消化病杂志

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表2　CyclinD1ASODN对胃癌细胞中CyclinD1、TS、TP、

DHFRmRNA的影响

SGC2790124h

CyclinD1TSTPDHFR

0126018311240153

48h0150014811480137

24h0117015911460146

3

TS、DHFRmRNA不同水平的下降,48h时这种下降更

明显,而在24h和48h时两种胃癌细胞中都有TP表达的升高。两种胃癌细胞中CyclinD1、TS、TP和DH2FR的表达情况见图1、2。ASODN组与空白对照组各基因表达相对强度的比值见表2。

HS2746T

48h0147013911600131

　　3ASOND组表达相对强度/空白对照组表达相对强度3　讨　　论图1　CyclinD1ASODN对胃癌细胞SGC27901中Cyc2

linD1、TS、TP、DHFR表达的影响

　11空白对照组　21正义对照组

　41反义组24h　51反义组48h

24h　31正义对照组48h

研究发现,细胞周期相关蛋白可以影响肿瘤细胞

对化疗药物的敏感性,在骨肉瘤细胞SaOs22中转染p21基因,增加了细胞对化疗药物阿霉素、氨甲喋呤、

[2]

TOMUDEX的敏感性,而针对不同目的基因的ASODN与传统的化疗药物相结合成为了一个新的研究方向。在实验中,CyclinD1ASODN能显著抑制Cy2clinD1mRNA的表达,因此我们进一步检测了CyclinD1ASODN对化疗药物敏感性的影响及其机制。

52FU抑制TS活性是其抗肿瘤作用的主要机制。对TS阻断的程度和持续性是决定52FU作用的基本

[3]

因素。TP是参与嘧啶核苷代谢的一种重要酶,TP使52FU转变成52FudR。52FudR能进一步被激活为52FdUMP,阻断TS的活性,从而发挥52FU的抗增殖作[4]

用。DHFR是参与RNA和DNA合成的一种重要酶,是MTX的主要作用靶点。MTX的化学结构与叶酸相似,可竞争性抑制DHFR活力。实验CyclinD1ASODN作用两种胃癌细胞24h后,细胞对52FU和MTX的IC50显著下降,同时发现两种细胞中TS、TP、DHFR的mRNA表达有明显改变,在48h时表达的改

变更明显。在其中起关键作用的是E2F。E2F是一种细胞转录活化因子,能诱导多种对通过G1/S期转换和起始DNA合成起重要作用的基因表达。其调节的目的基因包括CyclinD1、E、A、DHFR、核糖核苷酸还原酶、TS、胸苷激酶、DNA聚合酶α激酶、原癌基因

[5]

MYC、BMYB产物等。这些基因启动中都有E2F结合位点。E2F可以直接活化这些基因,启动DNA合成,使细胞进入S期。pRb蛋白可与E2F基因活化转录功能区内的一段18个氨基酸残基序列结合,抑制其活化转录功能,从而发挥其抗增殖作用。推测Cyc2linD1ASODN通过抑制CyclinD1的表达,影响CyclinD1/CDK/pRb/E2F通路,改变了细胞中TS、TP、DHFR的表达。这可能是CyclinD1ASODN能增加52FU、

图1　CyclinD1ASODN对胃癌细胞HS2746T中Cyclin

D1、ST、TP、DHFR表达的影响

　11空白对照组　21正义对照组

　41反义组24h　51反义组48h

24h　31正义对照组48h

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・158・　　　　　MTX化疗敏感性的内在机制。

　临床消化病杂志

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(收稿日期:2004208231)

在16株不同类型的肿瘤细胞中发

现CyclinD1高表达与CDDP耐受有关。CDDP对Cy2clinD1反义基因转染的喉鳞状细胞癌CCL223细胞有更高的杀伤率,IC50明显降低,提示降低CyclinD1表

Warenius等

[6]

达可能会增强CDDP的DNA损害作用。另外,降低Cyclin可能通过阻断自分泌的有丝分裂信号,从而增加细胞对CDDP的敏感性。CyclinD1ASODN能增加胃癌对CDDP化疗的敏感性,其具体机制还有待进一步研究。

我们的研究证实,CyclinD1ASODN能抑制胃癌细胞的生长,并能增加细胞对52FU、MTX、CDDP的化疗敏感性,说明ASODN技术是一种提高化疗药物疗效的可行方法。通过对细胞周期调控元件表达的影响,改变化疗药物代谢相关酶的表达,从而改变了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为改善化疗的疗效提供了新的途径。

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[7]

重组人表皮生长因子局部灌注治疗急性直肠出血性溃疡1例

高　燕,石德红,张亚萍,张　冲,赵明利　(中国人民解放军第三医院消化内科,宝鸡　712000)

关键词:　重组人表皮生长因子;　直肠出血性溃疡;　局部灌注

[中图分类号]R574163　[文献标志码]D　[文章编号]10052541X(2005)042158201

患者女性,57岁,因间断性便血半月余,加重4h于2004年3月入院。2004年2月患者因“急性脊髓炎”口服强的松50mg,2周后间断排暗红色大便,入院前4h持续排暗红色血便,外院测血压60/40mmHg,血红蛋白66g/L,建立静脉通路后送来我院。查体:血压100/60mmHg,重度贫血貌,胸2以下感觉、运动功能丧失,余无特殊。入院后查血常规示正细胞性贫血,大便常规红细胞3～6个/HP,白细胞+。反复多次大便培养及找寄生虫未发现病原体。胃镜检查正常。肠镜查示距肛门5cm处可见环形约占肠腔2/3范围黏膜不规则隆起,凹凸不平,质软,表点状糜烂、渗血、脓苔,病变旁黏膜正常。多部位活检显示肠黏膜慢性炎症。给予静脉止血、补充血容量、抗炎、生理盐水加去甲肾上腺素灌肠、蒙脱石散剂灌肠、肛管缠凡士林油纱条局部压迫止血治疗12d,效果均欠佳。因考虑患者高位截瘫,手术治疗伤口不易愈合,遂予生理盐水50ml加重组人表皮生长因子5ml加去甲肾上腺素6mg保留灌肠9d,2d后出血完全停止,10d后停药。复查血常规,大便隐血阴性,出院。2月后肠镜复查病变完全消失。

急性直肠出血性溃疡(AHRU)是一种原因不明,多伴发于其他严重的全身性疾病之后出现的直肠溃疡。临床特点为突出性无痛性大量便血。内镜下可见不规则或圆形浅溃疡,多位于直肠末端近齿状线部位,约占直肠周长的1/3或整个周长。此类溃疡的预后取决于原发病,如能止血,溃疡本身预后良好。

表皮生长因子(EGF)是一类广泛存在于人和动物体内的,可促进或抑制多类细胞生长的多肽,与细胞膜上受体结合可激活多种酶,对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞及血管内皮细胞有趋化作用,能促进DNA、RNA和羟脯氨酸的合成,调节蛋白质合成,完善胶原蛋白的构建,加快创面愈合速度。

通过对本例患者的治疗,我们认为对于内科常规治疗无效,且不宜手术治疗的急性直肠出血性溃疡的患者,选择EGF局部用药不失为一种有效方法。

(收稿日期:2004207215)

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