PCR扩增仪[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111454834 A(43)申请公布日 2020.07.28

(21)申请号 202010269685.5(22)申请日 2020.04.08

(71)申请人 中国科学院长春光学精密机械与物

理研究所

地址 130033 吉林省长春市经济技术开发

区东南湖大路3888号(72)发明人 吴文明　

(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人 刘新雷(51)Int.Cl.

C12M 1/38(2006.01)C12M 1/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图4页

(54)发明名称

PCR扩增仪(57)摘要

本申请公开了一种PCR扩增仪，包括位于密封抗压隔水舱的微处理器和电源、位于通过油相密封的湿舱内的流式PCR系统。流式PCR系统包括微管道、微泵、电磁阀和温度循环装置；微泵和电磁阀均与微管道相连；微泵基于压力自平衡原理实现内部压力由外界海水压力的平衡；温度循环装置的缝隙填充柔性抗压材料；电源用于为流式PCR系统和微处理器供电；微处理器用于通过控制微泵和电磁阀驱动流体按照预设流动速度和预设流动方向在微管道内流动以控制PCR试剂和样本自动添加；还用于控制温度循环装置的温度升降循环，从而在深海原位情况下有效实现对微生物种群数量的实时监控。

CN 111454834 ACN 111454834 A

权　利　要　求　书

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1.一种PCR扩增仪，其特征在于，包括位于密封抗压隔水舱的微处理器和电源、位于通过绝缘性油相液体密封的湿舱内的流式PCR系统；

所述流式PCR系统包括微管道、微泵、电磁阀和温度循环装置；所述微泵和所述电磁阀均与所述微管道相连；所述微泵基于压力自平衡原理实现内部压力由外界海水压力的平衡；所述温度循环装置的缝隙填充柔性抗压材料；

所述电源用于为所述流式PCR系统和所述微处理器供电；所述微处理器用于通过控制所述微泵和所述电磁阀驱动流体按照预设流动速度和预设流动方向在所述微管道内流动以控制PCR试剂和样本自动添加；还用于控制所述温度循环装置的温度升降循环。

2.根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述微泵包括带有输送管道的弹性储液器、压力平衡接口、注射器、推进器和伺服电机；

所述弹性储液器的输送管道的另一端通过所述压力平衡接口与所述注射器相连，以使所述弹性储液器内的液体经所述输送管道在压力作用下进入所述注射器内；所述推进器与所述伺服电机相连接，且所述伺服电机与所述微处理器相连，以在所述微处理器控制和所述伺服电机的驱动下向所述微管道相应区域输送液体。

3.根据权利要求2所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述注射器为钢制注射器。4.根据权利要求3所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述密封抗压隔水舱内还包括应急电源。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述微管道包括PCR扩增管道，所述温度循环装置包括对称设置于所述PCR扩增管道相对两侧的两组半导体制冷器结构、多个水冷槽和保温层，各水冷槽和各半导体制冷器结构均设置在所述保温层上。

6.根据权利要求5所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述半导体制冷器结构包括第一陶瓷层、第一铜板层、第二铜板层、第二陶瓷层、P型半导体、N型半导体和密封箱体；

所述密封箱体内部填充导热油性材料，且所述P型半导体和所述N型半导体设置在所述密封箱体内；

所述第一铜板层和所述第二铜板层分别紧贴所述密封箱体顶部和底部，所述第一陶瓷层与所述第一铜板层相紧贴，所述第二铜板层和所述第二陶瓷层相紧贴。

7.根据权利要求6所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述水冷槽包括4个，分别与一个半导体制冷器结构成对设置所述PCR扩增管道的四周，且水冷槽和相应半导体制冷器结构之间的间距值均相同。

8.根据权利要求7所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述密封箱体内部填充液体硅胶。9.根据权利要求8所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述密封抗压隔水舱和所述湿舱为胶囊式舱体。

10.根据权利要求9所述的PCR扩增仪，其特征在于，所述湿舱内部采用硅油密封。

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说　明　书PCR扩增仪

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技术领域

[0001]本申请涉及基于聚合酶链式反应技术设备制造技术领域，特别是涉及一种PCR扩增仪。

背景技术

[0002]PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)为一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其利用DNA在95℃左右时会发生变性，由双链DNA分解为两个单链DNA；分解为单链的DNA在下降至60℃左右时，单链DNA会与引物结合；与引物结合的DNA在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则进行半保留复制，复制完成后即可获得两倍的DNA。经过温度多次在95℃和60℃的循环，实现对DNA进行大量的扩增。基于PCR原理的PCR技术作为当今最为重要的分子生物学检测手段，可以快速识别细菌、病毒、真菌等微生物类型与耐药性突变，分析灵敏度远远超过其他检测手段；仅需要三四十分钟的短时间，便可以准确检测不同微生物种群数量，因此在食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、科研实验室、食品安全、化妆品检测、环境卫生等几乎所有的生命科学领域都有重要应用前景。[0003]可以理解的是，不同应用环境对PCR仪器的性能要求不同，诸如深海环境。目前PCR仪均属于台式仪器的范畴，无法满足深海、野外等环境下的使用要求以及长期核酸原位检测的需求。而随着深海微生物的研究需求，且深海环境特殊，其中的微生物和物质脱离原位环境后会发生变化，而且深海中超过90％微生物由于脱离原位环境等原因目前尚不可培养。

[0004]鉴于此，如何在深海原位情况下实现对微生物种群例如α-,δ-,γ-变形菌，浮霉菌，酸杆菌，双歧放线菌等数量的实时监控，进而分析深海环境演变、预测地球生态变化，是所属领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

[0005]本申请提供了一种PCR扩增仪，在深海原位情况下有效实现对微生物种群数量的实时监控。

[0006]为解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：[0007]本发明实施例提供了一种PCR扩增仪，包括位于密封抗压隔水舱的微处理器和电源、位于通过绝缘性油相液体密封的湿舱内的流式PCR系统；[0008]所述流式PCR系统包括微管道、微泵、电磁阀和温度循环装置；所述微泵和所述电磁阀均与所述微管道相连；所述微泵基于压力自平衡原理实现内部压力由外界海水压力的平衡；所述温度循环装置的缝隙填充柔性抗压材料；

[0009]所述电源用于为所述流式PCR系统和所述微处理器供电；所述微处理器用于通过控制所述微泵和所述电磁阀驱动流体按照预设流动速度和预设流动方向在所述微管道内流动以控制PCR试剂和样本自动添加；还用于控制所述温度循环装置的温度升降循环。[0010]可选的，所述微泵包括带有输送管道的弹性储液器、压力平衡接口、注射器、推进

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说　明　书

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器和伺服电机；

[0011]所述弹性储液器的输送管道的另一端通过所述压力平衡接口与所述注射器相连，以使所述弹性储液器内的液体经所述输送管道在压力作用下进入所述注射器内；所述推进器与所述伺服电机相连接，且所述伺服电机与所述微处理器相连，以在所述微处理器控制和所述伺服电机的驱动下向所述微管道相应区域输送液体。[0012]可选的，所述注射器为钢制注射器。[0013]可选的，所述密封抗压隔水舱内还包括应急电源。[0014]可选的，所述微管道包括PCR扩增管道，所述温度循环装置包括对称设置于所述PCR扩增管道相对两侧的两组半导体制冷器结构、多个水冷槽和保温层，各水冷槽和各半导体制冷器结构均设置在所述保温层上。[0015]可选的，所述半导体制冷器结构包括第一陶瓷层、第一铜板层、第二铜板层、第二陶瓷层、P型半导体、N型半导体和密封箱体；

[0016]所述密封箱体内部填充导热油性材料，且所述P型半导体和所述N型半导体设置在所述密封箱体内；

[0017]所述第一铜板层和所述第二铜板层分别紧贴所述密封箱体顶部和底部，所述第一陶瓷层与所述第一铜板层相紧贴，所述第二铜板层和所述第二陶瓷层相紧贴。[0018]可选的，所述水冷槽包括4个，分别与一个半导体制冷器结构成对设置所述PCR扩增管道的四周，且水冷槽和相应半导体制冷器结构之间的间距值均相同。[0019]可选的，所述密封箱体内部填充液体硅胶。[0020]可选的，所述密封抗压隔水舱和所述湿舱为胶囊式舱体。[0021]可选的，所述湿舱内部采用硅油密封。[0022]本申请提供的技术方案的优点在于，湿舱基于外置油囊式压力自平衡且用绝缘性油相液体密封，从而可保证了湿舱内部微泵，电磁阀的可靠工作；采用压力自平衡式微泵与电磁阀的顺序动作实现反应试剂和测试样本的顺序添加，完成细胞破壁、核酸释放，PCR反应试剂添加流程，实现深海高压环境有效的液体驱动，提高系统的自动化程度，无需人工添加试剂。整个过程由位于干舱的微控制器控制实现，并通过自带电源实现自主供能，整个流程无需人工操作，并可通过水密线路实现与母机的可靠通信；通过干湿分舱设计，不仅降低了设备的整体体积和成本，还可随深潜器工作，在深海原位情况下有效实现对微生物种群数量的实时监控。

[0023]应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本公开。

附图说明

[0024]为了更清楚的说明本发明实施例或相关技术的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0025]图1为本发明实施例提供的PCR扩增仪的一种具体实施方式结构图；[0026]图2为本发明实施例提供的微泵的一种视角下的具体实施方式结构图；

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CN 111454834 A[0027][0028][0029][0030]

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图3为本发明实施例提供的微泵的一种视角下的具体实施方式结构图；图4为本发明实施例提供的基于压力自平衡微泵的工作原理示意图；

图5为本发明实施例提供的温度循环装置的一种视角下的具体实施方式结构图；图6为本发明实施例提供的温度循环装置的另一种视角下的具体实施方式结构图7为本发明实施例提供的半导体制冷器结构的一种具体实施方式结构图；图8为本发明实施例提供的PCR扩增仪的另一种具体实施方式结构图。

图；

[0031][0032]

具体实施方式

[0033]为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0034]本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”“第四”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述特定的顺序。此外术语“包括”和“具有”以及他们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可包括没有列出的步骤或单元。[0035]本申请的发明人经过研究发现，目前PCR仪存在以下问题：[0036]1、反应依赖金属孔板:采用金属孔板作为反应的腔体，需要人工实现试剂添加等操作，不仅需要耗费人工时间，还容易造成反应试剂污染，自动化程度不高。[0037]2、两相液体的高温稳定性:依赖昂贵表面活性剂，成本很高。[0038]3、温度循环：均依赖传统PCR温度循环仪来完成核酸扩增条件，TEC片需要依赖大功率风扇制冷，功耗高，且只能在室温下实现稳定的温度循环。[0039]4、能耗与占地体积：仪器均需外接220V交流电源供能，并且PCR仪的体积较大，不利于深潜器的携带。[0040]鉴于此，本申请采用干湿分舱的设计方案，干舱为密封抗压隔水舱，干舱内布置电子元器件与供电电源。湿舱采用压力自平衡装置实现内部压力由外界海水压力的平衡，湿舱内布置流式PCR系统，可实现微生物破壁，遗传物质释放，PCR基因扩增与产物收集。流式PCR系统可通过全氟类微管道及油相的斥水基团提供的疏水性实现无表面活性剂添加的液滴稳定传输。并利用压力自平衡式微注射泵与电磁换向阀实现试剂与样品的顺序驱动，利用热控技术实现PCR反应区域的有效保温，TEC片实现温度循环，TEC的热端采用水冷冷却。基于以上技术，实现低功耗，小体积，低质量，可在深海低温高压环境下工作的原位PCR扩增系统，微处理器实现试剂样品的自动添加以及与母机数据的传递，满足深海微生物原位扩增的要求。

[0041]在介绍了本发明实施例的技术方案后，下面详细的说明本申请的各种非限制性实施方式。

[0042]首先参见图1，图1为本发明实施例提供的一种PCR扩增仪在一种实施方式下的结构框架图，本发明实施例可包括以下内容：

[0043]PCR扩增仪包括第一舱体1和第二舱体2，第一舱体1为干舱，也即第一舱体为密封

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抗压隔水舱，微处理器10和电源11位于第一舱体内。第二舱体2为湿舱，且第二舱体2内部填充绝缘性油相液体进行密封以保证设置在该舱内的元器件可以在深海环境中使用，第二舱体内部设置有流式PCR系统20，整个过程由位于干舱的微控制器10控制实现，并通过自带电源实现自主供能，整个流程无需人工操作，并可通过水密线路实现与母机的可靠通信以及母机功能。本申请所谓的干舱和湿舱是以与海水是否接触为标准，第一舱体1和第二舱体2的外形可以是圆柱式，也可以为胶囊式，这均不影响本申请的实现。可选的，湿舱内部采用硅油密封，硅油的绝缘性保证了湿舱内部微泵，电磁阀的可靠工作。[0044]在本申请中，流式PCR系统20包括微管道、微泵、电磁阀和温度循环装置。微泵和电磁阀均有多个，且基于实际应用场景设置在相应位置且均与微管道相连。微管道作为液体流动和液体输送管道，基于测试样本在PCR仪器中的不同反应过程可包括多个子管道，例如PCR扩增管道，破壁管道等，液体为测试样本、反应试剂、填充试剂等。微泵基于压力自平衡原理实现内部压力由外界海水压力的平衡，注射式微泵例如可以是蠕动泵，还可以是离心泵；压力自平衡原理可以是金属薄膜式的压力自平衡方法，可为波纹管式压力自平衡方法，还可以为液压缸式压力自平衡方法。温度循环装置用于在测试样本进行PCR扩增过程中进行温度循环和控制，以保证测试样本充分进行PCR扩增。为了适应深海环境，温度循环装置的缝隙填充柔性抗压材料，柔性抗压材料例如可为硅胶。此外，流式PCR系统20通过全氟类微管道及油相的斥水基团提供的疏水性实现无表面活性剂添加的液滴稳定传输，从而可避免使用价格高昂的表面活性添加剂。[0045]其中，电源11用于为流式PCR系统和微处理器及整个控制系统自主供电，为了提高系统可用性和稳定性，还可设置应急电源，用于在电源无法继续供电或出现故障时为整个系统供电。微处理器10包括伺服电机控制指令、温控指令、电磁阀指令的生成并发送至相应目的端。伺服电机控制指令发送给各微泵作为伺服电机控制信号控制微泵输送液体，电磁阀指令发送给各电磁阀用于控制电磁阀关闭和方向，从而通过控制微泵和电磁阀驱动流体按照预设流动速度和预设流动方向在微管道内流动以控制PCR试剂和样本自动添加，采用压力自平衡式微泵与电磁阀的顺序动作实现试剂的顺序添加，完成细胞破壁、核酸释放，PCR反应试剂添加等流程。温控指令发送给温度循环装置作为温控信息控制PCR扩增过程中的温度升降循环。

[0046]在本发明实施例提供的技术方案中，湿舱基于外置油囊式压力自平衡且用绝缘性油相液体密封，从而可保证了湿舱内部微泵，电磁阀的可靠工作；采用压力自平衡式微泵与电磁阀的顺序动作实现反应试剂和测试样本的顺序添加，完成细胞破壁、核酸释放，PCR反应试剂添加流程，实现深海高压环境有效的液体驱动，提高系统的自动化程度，无需人工添加试剂。整个过程由位于干舱的微控制器控制实现，并通过自带电源实现自主供能，整个流程无需人工操作，并可通过水密线路实现与母机的可靠通信；通过干湿分舱设计，不仅降低了设备的整体体积和成本，还可随深潜器工作，在深海原位情况下有效实现对微生物种群数量的实时监控。

[0047]作为一种可选的实施方式，请参阅图2-图4，微泵包括带有输送管道的弹性储液器21、压力平衡接口22、注射器23、推进器24和伺服电机。[0048]本发明实施例中，弹性储液器21的输送管道的另一端通过压力平衡接口22与注射器23相连，以使弹性储液器21内的液体经输送管道在压力作用下进入注射器23内；推进器

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24与伺服电机，且伺服电机与微处理器10相连接，以在微处理器10控制和伺服电机的驱动下向微管道相应区域输送液体。结合图4工作原理来说，在陆上，向钢制注射器23和弹性储液器21内充满试剂，此时在大气压下，钢制注射器23，弹性储液器21内外压力一致，可编程式推进器24可在伺服电机的带动下实现液体的输送。当微泵位于深海环境之内时，深海压力将挤压弹性储液器21，使得钢制注射器23内的压力随海水压力同步变换，进而满足PCR扩增仪在高压环境下试剂稳定输送的要求。[0049]其中，弹性储液器21是指该期间的材料为弹性材料，例如柔性塑料、硅胶等，也就是可在施加外部压力下受挤压将存储的液体挤压至输送管道中。为了提高系统抗压性，注射器23可为钢制注射器。[0050]由上可知，本发明实施例采用压力自平衡式微泵，通过压力平衡使PCR扩增仪可在深海的高压环境下实现试剂的可靠输送。[0051]作为另外一种可选的实施方式，为了提高系统性能，本申请还提供一种温度控制效果好的温度循环装置，确保测试样本更好的进行PCR扩增，请参阅图5-图7所示，包括下述内容：

[0052]温度循环装置用于控制测试样本在PCR扩增过程中所需温度，也即测试样本混合液体0在PCR扩增管道处的反应，相应的，温度循环装置即是设置在微管道的PCR扩增管道50处。温度循环装置可包括对称设置于PCR扩增管道相对两侧的两组半导体制冷器结构51、多个水冷槽52和保温层53，各水冷槽52和各半导体制冷器结构51均设置在保温层53上，保温层53可通过胶粘方式设置在PCR扩增管道50的四周，并将半导体制冷器结构51包围起来。保温层53材料例如可为PEP胶毡，PMMA等，本申请对此不作任何限定。[0053]其中，为了提高温度控制效率和准确度，水冷槽可包括4个，分别与一个半导体制冷器结构成对设置PCR扩增管道的四周，且水冷槽和相应半导体制冷器结构之间的间距值均相同。

[0054]为了提高温度循环装置的抗压系统，半导体制冷器结构可包括第一陶瓷层71、第一铜板层73、第二铜板层74、第二陶瓷层72、P型半导体、N型半导体和密封箱体75。第一铜板层73和第二铜板层74分别紧贴密封箱体顶部和底部，第一陶瓷层71与第一铜板层73相紧贴，第二铜板层74和第二陶瓷层72相紧贴。密封箱体75内部填充导热油性材料，例如箱体内部可填充液体硅胶或PDMS。P型半导体和N型半导体设置在密封箱体75内。[0055]此外，温度循环装置不仅可采用半导体制冷器加热片，还可基于相同思路采用PTC(Positive Temperature Coefficient，正温度系数热敏电阻)加热片，这均不影响本申请的实现，

[0056]由上可知，本发明实施例采用抗高压TEC设计，采用硅胶填充TEC中间的空隙，使其可以在深海高压环境下使用；采用水冷式散热，利用湿舱内部的低温硅油实现TEC热端的高效散热，进而实现低功耗的PCR温度循环，可实现PCR反应区域的有效保温。[0057]为了使所属领域技术人员更加清楚明白的理解本申请技术方案，本申请还以具体实例阐述本申请的技术方案，请参阅图8所示，PCR扩增仪的微泵包含多个，为了更加清楚阐述技术方案，基于不同工作需求可分为流体推送微泵82、裂解试剂分配微泵86、PCR试剂分配微泵89，温度循环装置采用图5所示结构，包括下述内容：

[0058]将PCR反应试剂和硅油在陆地上以人工的方法加入到湿舱和弹性储液器81中去，

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完成加液后，将PCR扩增仪放置到深海工作环境中，分选富集后的微生物由分选设备泵入PCR扩增仪中，流体推送微泵82工作，电磁阀83开启，输送富含微生物的海水样品，同时电磁阀85开启，裂解试剂分配微泵86工作，海水样品与裂解试剂在混匀芯片84中完成试剂与样品的混匀，然后电磁阀85，裂解试剂分配微泵86关闭，流体推送微泵82将混匀好的试液输送到裂解器87中，流体推送微泵82停止工作，同时微控制器10发送指令，裂解器7内的四片半导体制冷器加热片加热，完成微生物的裂解与核酸物质的释放。电磁阀88开启，流体推送微泵82与PCR试剂分配微泵89工作，将富含核酸的样品与PCR反应试剂推入混匀芯片810中，使得两种试液充分混合，之后电磁阀88关闭，PCR反应试剂分配微泵89停止。混合后的试液进入PCR反应器811中，流体推送微泵82停止工作，PCR反应器安装有4片半导体制冷器加热片，在微型控制器10的控制下实现40个95℃-60℃的温度循环。具体温度循环过程为：设置半导体制冷器加热片的温度为60℃，95℃，其中试液在60℃的状态下维持30s，在95℃的状态下维持10s。样品完成60℃→95℃→60℃为循环一圈，其中的DNA就进行了一次复制，经过半导体制冷器加热片的制冷与制热热反复进行就可以完成PCR扩增。完成扩增后，微型控制器10发送指令，流体推送微泵82工作将扩增产物输送到产物收集器812中。[0059]由上可知，本发明实施例具有如下技术效果：PCR反应在高压湿舱内进行，使得深海微生物裂解前保持活性，遗传物质无丢失；全程采用微控制器实现液体试剂的分配与运输，确保样品核酸无污染；采用压力自平衡式微泵实现了深海高压环境有效的液体驱动；采用抗高压TEC，结合水冷式温控模式，实现了低能耗的温度循环；干湿舱设计降低了设备的整体体积和成本，可随深潜器工作；有效的热控，保证了在深海低温环境下的有效核酸扩增；实现了低能耗的电池自主供电，并兼容母机供能。[0060]本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

[0061]专业人员还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。

[0062]以上对本申请所提供的一种PCR扩增仪方法、装置及计算机可读存储介质进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本申请进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本申请权利要求的保护范围内。

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