一种长效低毒和具有氧化响应的铁离子螯合剂[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105504088 A (43)申请公布日 2016.04.20

(21)申请号 201610076941.2(22)申请日 2016.02.03

(71)申请人四川大学华西医院

地址610041 四川省成都市武侯区国学巷

37号(72)发明人田猛 陈茜 李浩 郑峻 游潮(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务

所(普通合伙) 51222

代理人李高峡(51)Int.Cl.

C08B 37/04(2006.01)A61P 3/00(2006.01)A61P 25/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图4页

(54)发明名称

一种长效低毒和具有氧化响应的铁离子螯合剂(57)摘要

本发明公开了一种长效低毒和具有氧化响应的铁离子螯合剂，它是去铁胺接枝的氧化海藻酸钠。经试验证明，其不但可以对去铁胺起到保护的作用，避免被体内的酶快速降解，提高其半衰期和降低毒性，而且引入的海藻酸钠分子链段还能响应由于铁离子过载产生的氧化环境而快速降解从而排除体外，避免产生积累毒性。因此，相比于目前临床上直接使用去铁胺，本发明制备的新型药物可同时提供长效低毒去铁和氧化响应降解的功能。同时，本发明产品所需的生产条件要求较低、容易实现，并且原材料来源广泛，价格低廉，具备广阔的应用前景。 C N 1 0 5 5 0 4 0 8 8 ACN 105504088 A

权　利　要　求　书

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1.一种改性氧化海藻酸钠，其特征在于：它是去铁胺接枝的改性氧化海藻酸钠。2.根据权利要求1所述的改性氧化海藻酸钠，其特征在于：它具有下述式(Ⅰ)所示的结构：

Rn-CH2-DFO (Ⅰ)其中，Rn表示氧化海藻酸钠主链，DFO表示去铁胺基，结构如下：

3.根据权利要求1或2所述的改性氧化海藻酸钠，其特征在于：去铁胺基的数量/海藻酸钠结构单元＝0.05～0.5。

4.根据权利要求1或2所述的改性氧化海藻酸钠，其特征在于：所述氧化海藻酸钠的氧化度为5％～42％。

5.根据权利要求1-4任一项所述的改性氧化海藻酸钠，其特征在于：所述改性氧化海藻酸钠的重均分子量为10000-300000Da，优选的重均分子量为62000-290000Da。

6.根据权利要求1所述的改性氧化海藻酸钠，其特征在于：所述改性氧化海藻酸钠在2931cm-1、2858cm-1和1460cm-1处有红外吸收峰；在核磁氢谱的1.2-3.5ppm和3.6-4.9ppm化学位移处有峰。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述接枝氧化海藻酸钠的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)取氧化海藻酸钠，溶于水中，加入去铁胺反应完全；(2)再加入硼氢化试剂反应，分离纯化即得。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述硼氢化试剂选自氰基硼氢化钠或/和硼氢化钠。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，先加入氰基硼氢化钠，再加入硼氢化钠。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于：所述氧化海藻酸钠与去铁胺的质量比为1：1～1：3.6；所述硼氢化试剂与去铁胺的摩尔比为3:1。

11.权利要求1-7任一项所述改性氧化海藻酸钠作为铁离子螯合剂的应用。

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一种长效低毒和具有氧化响应的铁离子螯合剂

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技术领域

[0001]本发明涉及聚合物，具体涉及一种去铁胺接枝氧化海藻酸钠，还涉及其作为铁离子螯合剂的应用。

背景技术

[0002]铁离子过载与各种疾病相关，如脑出血后血红蛋白降解产生的铁离子会导致严重的脑损伤，如脑水肿、神经元死亡、脑萎缩及神经功能的缺失等。[0003]去铁胺是一种铁离子鳌合剂，在临床上已经使用了30余年，用于治疗各种原因引起的急慢性铁过载。然而，在血液中的去铁胺会被体内的酶快速降解，其半衰期仅为20分钟。因此要达到一定的药效就需要大剂量摄入，但是在大剂量下该药会导致毒性作用。因此，在临床上所以临床上一直采用低剂量下长时间的静脉注射来维持其在体内的浓度以达到一定的治疗效果，治疗时十分不便，也容易产生累积毒性。[0004]海藻酸钠是一种天然多糖，其结构为β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)的无规嵌段共聚物，其结构式和连接方式如下：

[0005]

[0006]

目前尚没有将海藻酸盐与去铁胺结构基团相结合的报道。

发明内容

[0007]为解决上述问题，本发明提供了一种以海藻酸钠为载体的去铁胺。[0008]本发明提供了一种改性氧化海藻酸钠，它是去铁胺接枝的改性氧化海藻酸钠。[0009]进一步地，它具有下述式(Ⅰ)所示的结构：[0010]Rn-CH2-DFO   (Ⅰ)[0011]其中，Rn表示氧化海藻酸钠主链，DFO表示去铁胺基，结构如下：

[0012]

进一步地，去铁胺基的数量/海藻酸钠结构单元＝0.05～0.5。[0014]本发明中，所述“海藻酸钠结构单元”指的是未被氧化的糖醛酸结构单元(G单元或M单元)与氧化后的糖醛酸结构单元(包括接枝和未接枝的)之和，例如图1中海藻酸钠-铁离子螯合剂，该片段中所示的海藻酸钠结构单元的数量为4，去铁胺基的数量为3。

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[0013]

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进一步地，所述氧化海藻酸钠的氧化度为5％～42％。

[0016]进一步地，所述改性氧化海藻酸钠的重均分子量为10000-300000Da。[0017]更进一步地，所述改性氧化海藻酸钠的重均分子量为62000-290000Da。[0018]进一步地，所述改性氧化海藻酸钠在2931cm-1、2858cm-1和1460cm-1处有红外吸收峰；在核磁氢谱1.2-3.5ppm和3.6-4.9ppm的化学位移处有峰。

[0019]本发明还提供了一种制备所述接枝氧化海藻酸钠的方法，包括以下步骤：[0020]取氧化海藻酸钠，溶于水中，加入去铁胺反应完全，再加入硼氢化试剂反应，分离纯化即得。

[0021]进一步地，所述硼氢化试剂选自氰基硼氢化钠或硼氢化钠。[0022]进一步地，步骤(2)中，所述硼氢化试剂选自氰基硼氢化钠或/和硼氢化钠。[0023]进一步地，所述步骤(2)中，是先加入氰基硼氢化钠，再加入硼氢化钠。[0024]进一步地，所述氧化海藻酸钠与去铁胺的质量比为1：1～1：3.6；所述硼氢化试剂与去铁胺的摩尔比为3:1。

[0025]本发明还提供了所述改性氧化海藻酸钠作为铁离子螯合剂的应用，具体的机理如图1的海藻酸钠-去铁胺螯合剂所示。

[0026]本发明的去铁胺接枝氧化海藻酸钠解决了传统铁离子螯合剂去铁胺的缺点，利用亲水生物相容好的海藻酸钠对去铁胺进行了化学修饰。经试验证明，其不但可以对去铁胺起到保护的作用，避免被体内的酶快速降解，提高其半衰期和降低毒性，而且引入的海藻酸钠分子链段还能响应由于铁离子过载产生的氧化环境而快速降解从而排除体外，避免产生积累毒性。因此，相比于目前临床上直接使用去铁胺，本发明制备的新型药物可同时提供长效低毒去铁和氧化响应降解的功能。同时，本发明产品所需的生产条件要求较低、容易实现，并且原材料来源广泛，价格低廉，具备广阔的应用前景。[0027]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0028]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0029]图1为本发明海藻酸钠-去铁胺螯合剂的合成及去铁胺螯合铁离子示意图。[0030]图2为Alg1、Alg2、DFO、ADA1、ADA2、Alg-DFO1和Alg-DFO2的红外图谱。[0031]图3为Alg1、Alg2、DFO、ADA1、ADA2、Alg-DFO1和Alg-DFO2的核磁氢谱。[0032]图4为实施例7中稳定性和半衰期试验的检测结果。[0033]图5为实施例7中的氧化响应试验的检测结果。[0034]图6-8依次为实施例7中为1天、2天和4天的细胞活率MTT测试结果。[0035]图9为实施例7中细胞毒性试验中细胞形态观察图，标尺为50微米。具体实施方式

[0036]所用原料和试剂均来自于市售的商品。

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海藻酸钠Alg1(sigma,粘度大或等于2000cps)，海藻酸钠Alg2(青岛晶岩，粘度

100cps)去铁胺DFO(sigma)；MTT(sigma)；氰基硼氢化钠和硼氢化钠(上海阿拉丁试剂)过氧化氢(成都科龙)。

[0038]实施例1去铁胺接枝氧化海藻酸钠的制备[0039]取5克海藻酸钠Alg1溶于400毫升蒸馏水中，加入0.27克高碘酸钠，避光搅拌12小时后，加入5毫升乙二醇搅拌2小时终止反应。然后加入5克氯化钠和1升乙醇沉淀分离得到氧化海藻酸钠，反复溶解沉淀3次除去多余杂质后，透析3天，然后冷冻干燥得到高纯度的氧化海藻酸钠。氧化度采用盐酸羟胺法滴定(Xu,et al.Carbohydrate Polymers,2013,95,148-154.)测得为5％。

[0040]取0.5克氧化海藻酸钠溶于30毫升蒸馏水中，然后加入0.5克去铁胺搅拌反应，2小时后加入与去铁胺等摩尔的氰基硼氢化钠，搅拌还原4小时。然后加入2倍去铁胺摩尔量的硼氢化钠继续搅拌还原24小时。最后反应液透析3天，每天换一次水，然后冷冻干燥得到铁离子螯合剂。

[0041]去铁胺含量采用分光光度法(Hallaway,et al.PNAS,1989,86,10108-10112.)检测，结果为每20个海藻酸钠结构单元含有1个去铁胺分子。分子量采用凝胶色谱检测，结果为290kDa。

[0042]实施例2去铁胺接枝氧化海藻酸钠的制备[0043]取5克海藻酸钠Alg1溶于400毫升蒸馏水中，加入0.81克高碘酸钠，避光搅拌6小时后，加入10毫升乙二醇搅拌2小时终止反应。然后加入5克氯化钠和1升乙醇沉淀分离得到氧化海藻酸钠，反复溶解沉淀3次除去多余杂质后，透析3天，然后冷冻干燥得到高纯度的氧化海藻酸钠。氧化度采用盐酸羟胺法滴定测得为13.1％。[0044]取0.5克氧化海藻酸钠溶于30毫升蒸馏水中，然后加入0.8克去铁胺搅拌反应，2小时后加入与去铁胺等摩尔的氰基硼氢化钠，搅拌还原4小时。然后加入2倍去铁胺摩尔量的硼氢化钠继续搅拌还原24小时。最后反应液透析3天，每天换一次水，然后冷冻干燥得到铁离子螯合剂。去铁胺含量采用分光光度法检测，结果为每11个海藻酸钠结构单元含有1个去铁胺分子。分子量采用凝胶色谱检测，结果为245kDa。[0045]实施例3去铁胺接枝氧化海藻酸钠的制备[0046]取5克海藻酸钠Alg1溶于400毫升蒸馏水中，加入1.62克高碘酸钠，避光搅拌6小时后，加入15毫升乙二醇搅拌2小时终止反应。然后加入5克氯化钠和1升乙醇沉淀分离得到氧化海藻酸钠，反复溶解沉淀3次除去多余杂质后，透析3天，然后冷冻干燥得到高纯度的氧化海藻酸钠ADA1。氧化度采用盐酸羟胺法滴定测得为26.8％。

[0047]0.5克氧化海藻酸钠溶于30毫升蒸馏水中然后加入1.2克去铁胺搅拌反应，2小时后加入与去铁胺等摩尔的氰基硼氢化钠，搅拌还原4小时。然后加入2倍去铁胺摩尔量的硼氢化钠继续搅拌还原24小时。最后反应液透析3天，每天换一次水，然后冷冻干燥得到铁离子螯合剂Alg-DFO1。去铁胺含量采用分光光度法检测，结果为每7个海藻酸钠结构单元含有1个去铁胺分子。分子量采用凝胶色谱检测，结果为128kDa。[0048]实施例4去铁胺接枝氧化海藻酸钠的制备[0049]取5克海藻酸钠Alg2溶于400毫升蒸馏水中，加入1.62克高碘酸钠，避光搅拌6小时后，加入15毫升乙二醇搅拌2小时终止反应。然后加入5克氯化钠和1升乙醇沉淀分离得到氧

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化海藻酸钠，反复溶解沉淀3次除去多余杂质后，透析3天，然后冷冻干燥得到高纯度的氧化海藻酸钠ADA2。氧化度采用盐酸羟胺法滴定测得为28.6％。

[0050]0.5克氧化海藻酸钠溶于30毫升蒸馏水中然后加入1.2克去铁胺搅拌反应，2小时后加入与去铁胺等摩尔的氰基硼氢化钠，搅拌还原4小时。然后加入2倍去铁胺摩尔量的硼氢化钠继续搅拌还原24小时。最后反应液透析3天，每天换一次水，然后冷冻干燥得到铁离子螯合剂Alg-DFO2。去铁胺含量采用分光光度法检测，结果为每7个海藻酸钠结构单元含有1个去铁胺分子。分子量采用凝胶色谱检测，结果为87kDa。[0051]实施例5去铁胺接枝氧化海藻酸钠的制备

[0052]取5克海藻酸钠Alg1溶于400毫升蒸馏水中，加入2.7克高碘酸钠避光搅拌6小时后，加入20毫升乙二醇搅拌2小时终止反应。然后加入5克氯化钠和1升乙醇沉淀分离得到氧化海藻酸钠，反复溶解沉淀3次除去多余杂质后再透析3天然后冷冻干燥得到高纯度的氧化海藻酸钠。氧化度采用盐酸羟胺法滴定测得为43.2％。

[0053]0.5克氧化海藻酸钠溶于30毫升蒸馏水中然后加入1.8克去铁胺搅拌反应，2小时后加入与去铁胺等摩尔的氰基硼氢化钠，搅拌还原4小时。然后加入2倍去铁胺摩尔量的硼氢化钠继续搅拌还原24小时。最后反应液透析3天，每天换一次水，然后冷冻干燥得到铁离子螯合剂。去铁胺含量采用分光光度法检测，结果为每5个海藻酸钠结构单元含有1个去铁胺分子。分子量采用凝胶色谱检测，结果为62kDa。[0054]实施例6Alg1、Alg2、DFO、ADA1、ADA2、Alg-DFO1和Alg-DFO2的红外和核磁表征图谱(

[0055]红外：KBr压片法。核磁氢谱(Bruker AV II-400MHz)：10毫克试样溶于1毫升重水，25摄氏度检测。

[0056]分别测试了结果分别如图2和图3所示。[0057](1)红外光谱的分析结果如下：[0058]Alg1和Alg2的红外归属峰：3400cm-1(O-H伸缩振动)，2926cm-1(C-H伸缩振动)，1612和1417cm-1(分别为COO-的非对称和对称伸缩振动)，1200-970cm-1(C-C，C-O和糖苷键中的C-O-C伸缩振动)。[0059]ADA1和ADA2：相比于原料红外，氧化海藻酸钠出现了一个新的峰在1730cm-1，此峰对应醛基的对称伸缩振动。[0060]去铁胺原料：3313和3104cm-1(N-H伸缩振动)，2931和2858cm-1(分别为CH2的非对称和对称伸缩振动)，1628cm-1(C＝O伸缩振动)，1566cm-1(N-H弯曲振动)，1460cm-1(CH2弯曲振动)，1200cm-1(C-C伸缩振动)，1053cm-1(N-O伸缩振动)。[0061]Alg-DFO1和Alg-DFO2：1730cm-1的峰消失表明醛基反应。DFO中的CH2的弯曲振动在1460cm-1可见。[0062]因此，红外的检测结果表明，DFO成功接枝到了海藻酸钠的主链上。[0063](2)核磁谱图的分析结果如下：[0064]Alg1和Alg2的核磁峰：4.2-4.9ppm(G-1,M-1,和G-5的氢)；3.6-4.1ppm(G-2,G-3,G-4,M-2,M-3,M-4,和M-5的氢)[0065]ADA1和ADA2：4.2ppm的新峰对应氧化G单元上的G-5的氢；5.3和5.5ppm的新峰对应醛基和氢键反应形成的半缩醛的氢。

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去铁胺原料DFO：2.0和2.8ppm分别对应–CH3和CH3SO3H的氢；1.2-1.6ppm(H-2,H-3,

H-4,H-9,H-10,H-11,H-16,H-17和H-18)；2.4-3.5ppm(H-1,H-5,H-6,H-7,H-8,H-12,H-13,H-14,H-15和H-19)。

[0067]Alg-DFO1和Alg-DFO2：1.2-3.5ppm(DFO中的氢)；3.6-4.9ppm(海藻酸钠中的氢)。[0068]以上结果同红外结果一致，进一步表明DFO成功接枝到了氧海藻酸钠的主链上。[0069]实施例7本发明去铁胺接枝氧化海藻酸钠作为铁离子螯合剂的应用[0070]1、稳定性和半衰期检测

[0071]稳定性采用代谢实验检测(Meyer-brunot&Keberle，Biochem.Pharmaco.l,1967,16,527-535)。步骤为：9毫克螯合剂Alg-DFO1和Alg-DFO2分别溶于10毫升KRB缓冲液后加入2毫升新鲜血浆，然后在37度，95％氧气和5％二氧化碳气氛中震荡，每隔一定时间吸出1毫升反应液，经处理后采用紫外-可见光谱在429nm检测吸光度。[0072]结果如图4所示。

[0073]对应标准曲线计算出孵化不同时候后孵化液中的有效去铁胺浓度，图4中，A、B、C分别为DFO，Alg-DFO1和Alg-DFO2在不同孵化时间后的全波长吸光曲线。根据吸光度曲线将时间和对应浓度作图，曲线经拟合得到图D，然后计算半衰期。[0074]根据计算，去铁胺的半衰期仅为48分钟，而本发明螯合剂的半衰期分别为11.4和8.1个小时，分别为去铁胺的10和14倍。[0075]可见，本发明的铁离子螯合剂显著提升了去铁胺的半衰期。[0076](2)氧化响应

[0077]螯合剂加入0.1％的过氧化氢溶液中，螯合剂浓度为1毫克/毫升，在37度下的水浴中震荡孵化，每过一定时间吸出一定孵化液，采用凝胶色谱检测分子量的变化。另外有效去铁胺浓度采用上面的方法同时检测。[0078]结果图5所示。[0079]图5中，如图A所示，90分钟内螯合剂在氧化环境下分子量下降了90％，表明螯合剂具有快速氧化响应的性能。另外在氧化环境下螯合剂和对照的去铁胺的铁离子螯合能力都表现出下降(如图B)，表明氧化环境对铁离子螯合能力有削弱，但是制备的螯合剂明显比对照去铁胺下降幅度要小，表明海藻酸钠对去铁胺有保护作用。[0080](3)细胞毒性

[0081]采用MTT法检测细胞毒性。Alg-DFO1，Alg-DFO2，和DFO溶于磷酸缓冲液PBS中配制成含10mM等效DFO浓度的溶液，用于细胞试验时，再用培养基稀释成含0.5,0.2,0.1,0.05,0.01,and 0.005mM等效DFO浓度的溶液。对照组采用等体积的PBS加入培养基。人脐静脉内皮细胞按3×103的密度种于96孔板，24小时后吸弃培养基，加入上述含不同浓度的螯合剂培养基，继续培养1天，2天和4天，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，然后采用MTT法检测人脐静脉内皮细胞毒性(Tian,et al.,CarbohydratePolymers,2010,79,137-144)。[0082]1天、2天和4天的细胞活率MTT测试结果依次如图6、7、8所示。[0083]去铁胺具有剂量和时间依赖性的细胞毒性，从图中看出当DFO的浓度高于0.05mM时培养1天后细胞活率下降为68.4-78.1％。相对比，Alg-DFO1和Alg-DFO2的等效DFO浓度大于0.1mM时才表现出明显的细胞活率下降。并且每一个等效DFO浓度下，Alg-DFO1和Alg-DFO2的实验组的细胞活率都明显高于DFO组。随着培养时间的延长，2天和4天的结果与第1

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天的结果相似。

[0084]从图9所示的细胞形态上观察，低剂量的等效DFO浓度下细胞表现出正常的梭形形态，随着浓度增加，更多细胞变为圆形，在DFO试验组中出现了更多细胞的死亡。而对于Alg-DFO1和Alg-DFO2的实验组的细胞仍然保持铺展形态并且死亡的细胞比DFO实验组明显要少，这与MTT结果是一致的。[0085]以上结果表明：螯合剂的细胞毒性明显小于对照组去铁胺的细胞毒性。[0086]综上所述，本发明提供了一种长效低毒和具有氧化响应的铁离子螯合剂，它是去铁胺接枝的氧化海藻酸钠。经试验证明，其不但可以对去铁胺起到保护的作用，避免被体内的酶快速降解，提高其半衰期和降低毒性，而且引入的海藻酸钠分子链段还能响应由于铁离子过载产生的氧化环境而快速降解从而排除体外，避免产生积累毒性。因此，相比于目前临床上直接使用去铁胺，本发明制备的新型药物可同时提供长效低毒去铁和氧化响应降解的功能。同时，本发明产品所需的生产条件要求较低、容易实现，并且原材料来源广泛，价格低廉，具备广阔的应用前景。

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