第五章 种子生活力和活力测定

本章讲2节§1、种子生活力测定原理及方法

§2、种子活力测定原理及方法

第一节 种子生活力测定的原理与方法

在种子贸易中，时常需要在短时间内掌握种子批的生活力状况，如果种子处于休眠状态难以通过发芽测定得到结果，种子生活力测定可以满足这一要求。 一、种子生活力概念：

种子生活力(seed viability)指种子发芽的潜在能力或种胚具有的

生命力；

种子生活力和发芽具有不同的含义：

一些休眠种子在发芽试验中不能发芽，但它是有生活力的，破除休眠后，能长成正常幼苗。而生活力反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总和。所以，种子生活力测定，反映的是种子批的最大发芽潜力。

二、种子生活力测定的意义 1、测定休眠种子的生活力

新收获的或在低温贮藏处于休眠状态的种子，正常发芽条件下，其发芽力很低，这种情况下，仅用发芽试验测定其发芽率，就不可能测出种子的最高发芽率。必须进行生活力测定，了解种子的发芽潜力，合理利用种子。 （怎样利用？）

播种之前对发芽率低而生活力高的种子，应进行适当处理后播种。 种子检验时，发芽试验末期有新鲜不发芽的种子或硬实种子，就应接着进行生活力测定；或破除休眠后做发芽试验。 2、快速预测种子的发芽力:

休眠种子可借助于各种预处理打破休眠，进行发芽试验，但时间较长；而种子贸易中，因时间紧迫，不可能采用标准发芽试验来测定发芽力，

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因为发芽试验所需的时间较长。如小麦8d，水稻14d，菠菜21d。 而多数林木种子则需要更长的时间（如月季15～25℃发芽，70d计算发芽率）。这时，可用生物化学法测定种子生活力作为参考；而林木种子可用生活力来代替发芽力。

种子生活力测定方法有四唑染色法、靛蓝染色法、红墨水染色法、软X射线造影法等。

本节将重点介绍四唑染色法，并简要介绍其他方法。 三、四唑测定法（GB） (一)四唑测定法概述 1、发展简史

四唑测定法于1942年由德国G.Lakon(莱康)教授发明，二战期间传人美国。ISTA于1950年成立四唑测定技术委员会，1953年首次将四唑测定列入国际种子检验规程，主持编写《四唑测定手册》，经过多次ISTA会议讨论修改，于1984年正式公布发行。该手册汇集了650多个种属的具体测定技术，是四唑测定的权威性参考书。目前国际和国家检验规程都将其列于正式检验项目，它是测定种子生活力公认的最有效的方法。 2、四唑测定方法的特点

四唑测定是一种世界公认、省时快速、结果可靠的种子生活力 测定方法。有以下几个特点：

1）原理可靠，结果准确：主要是按胚的染色图形来判断种子的死与活，该技术已发展成熟。如果能正确使用四唑测定方法，四唑测定结果与发芽率误差一般不会超过3～5％。

2）不受休眠限制：利用种子内部的还原反应显色来判断种子的死与活，不受休眠限制。

3）方法简便，省时快速：所需仪器设备和物品较少（恒温箱、培养皿、刀片、镊子、放大镜和四唑药品等）。测定方法也较为简便，

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一般只需6～24h就能获得结果。特别是同发芽试验相比是很快的。 4）成本低廉：由于四唑测定所需仪器、物品少和方法简便， 所以每个样品测定所花成本很低。

四唑测定也有缺陷：对种子检验员经验和技能要求较高；

结果不能提供休眠的程度。

3、适用范围：

根据1996国际种子检验规程，四唑测定适用于下列范围：（p61） (1)测定深度休眠种子；收获后需马上播种的种子；发芽缓慢的种子；要求估测发芽潜力的种子。另外，也适用于：

(2)测定发芽末期未发芽种子的生活力，特别是怀疑有休眠时。 (3)测定种子收获或加工过程中的种子损伤的原因(如热害、机械损

伤、虫蛀等)。

(4)解决发芽试验中存在的问题，如查明不正常幼苗产生的原因； 怀疑杀菌剂、种子包衣的处理效果等。 (二)、四唑测定法的原理

有生活力的种子活细胞内有脱氢酶，可与氧化还原反应指示剂：四唑（无色）反应而显色，被还原成为红色、稳定的三苯基甲腊(triphenyl formazam)。可根据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。

除了完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能出现一些部分染色的种子。说明在不同部位存在面积大小不同的坏死组织。

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判断种子有无生活力，主要看胚和胚乳不染色坏死组织的部位及面积大小，而不完全取决于染色的深浅。染色的深浅可以区别健壮程度。即染色愈深，种子生活力愈旺盛。

四唑染色是一酶促反应，反应不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反应温度、pH等因素的影响。 (三)、四唑测定法应用的化学试剂 1、四唑

四唑盐类有多种，常用的是2，3，5—氯化三苯基四氮唑， ｛英文2，3，5—triphenyl tetrazo1ium chloride｝，缩写为TTC。 （1）特性

①白色或淡黄色粉剂，易溶于水，有微毒，使用时不要接触（少接触）。②见光易被还原成粉红色，需用棕色瓶包装，再裹一层黑纸。同样，配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里，暗处保存，种子染色也需在暗处和弱光处进行。 （2）四唑液浓度

常用的四唑染色浓度为0.1％～1.0％(m/v)．一般来说: 切开种胚的种子可用0.1％～0.5％的四唑溶液； 整个胚、整粒种子需用1.0％的四唑溶液。 （3）pH:

四唑溶液的pH要求在6.5～7.5，若溶液的pH不在此范围，反应不能正常进行。因此，对于游离酸含量高的四唑应当用缓冲液配制。 即一般国产的四唑游离酸含量高，要用缓冲液配制（进口的可直接用蒸馏水配制）。

配制方法：称取lg（或0.1g）四唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲液中，

即配成1.0％（或0.1％）的四唑溶液；

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当用酸度计测定时，若四唑液的pH值达不到要求，则可用稀NaOH或NaHCO3溶液加以调节。

配好的四唑溶液应保存在棕色瓶里，一般有效期可保持数个月。若存放在冰箱里，有效期更长。 2、磷酸缓冲液：其配方如下：

(1)ISTA及GB规程法：首先配两种溶液，然后按比例混合即成。 溶液I：称取9.078g KH2PO4（磷酸二氢钾)溶解于l000ml蒸馏水中; 溶液Ⅱ：称取9.472g Na2HPO4（磷酸氢二钠)

或11.876g Na2HPO4.2H2O溶解于1000mL蒸馏水之中。

然后取溶液I：2份和溶液Ⅱ：3份混合即成。 以上比较麻烦，也可用北美官方种子检验规程：

(2)AOSA规程法：在1000mL蒸馏水中加入5.450g NaH2PO4和3.790g Na2HPO4充分溶解即成。 3、乳酸苯酚透明液：

用于染色后的小粒豆类和牧草种子，经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变得透明，以便透过这些部分清楚地观察其胚的染色情况。 配法：20mL乳酸＋20mL苯酚(若苯酚是结晶形式，则需溶化为液体)＋40mL甘油＋20mL蒸馏水混合而成。

该药液有毒性，在使用时防止触及皮肤或衣服等。配制时最好戴塑胶薄膜手套，并在通风橱里操作。

（四）、四唑测定法的程序 参照96版《国际种子检验规程》及95GB: 1、试验样品：

随机数取净种子100粒，2～4次重复（GB 2～4次重复，

ISTA 4次重复）

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2、种子预处理（预措预湿）

(1)目的：大部分种子在测定前都需经过预处理。

目的：使种子加快和充分吸湿，软化种皮，方便样品准备，促进酶的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确性。

因为种子吸湿后，切开、针挑种皮或切开营养组织变得容易， 而干种子则工作困难，并且活细胞内的酶尚未活化，染色效果不良。因此，预措预湿对正确测定是很重要的。

(2)预措：指在种子预湿前除去种子外部的附属物。包括剥去果壳和

在种子非要害部位弄破种皮。如水稻种子需脱去稃壳； 花生剥去果壳；豆科硬实种子需刺破种皮等。

注意：预措不能损伤种子内部胚的主要构造。而大多数种子则不需

预措处理。

(3)预湿：是四唑染色测定的必要步骤。

因为吸账种子一般比干种子不易破碎，比较容易切开或刺破种皮。 目前常用预湿方法有二种：

①缓慢吸湿：将种子放在纸上或纸间吸湿。 适用于：直接浸在水中容易破裂的种子；

已经劣变的种子（陈种子）； 过分干燥的种子。

缓慢吸湿，能较好地解决吸湿和供氧的矛盾。

GB规定：像大豆、菜豆、葱、花生等种子要求缓慢纸床预湿。

禾谷类种子既可水浸预湿，也可缓慢纸床预湿。

缓慢预湿可采用下面两种方法：

a 纸床上预湿：小粒豆类种子，如苜蓿、三叶草等种子。

b 纸卷或纸间预湿：像大豆、菜豆、豌豆等种子。

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②快速水浸预湿：将种子完全浸入水中，充分吸胀。

因为种子直接浸入水中，吸水快、吸水均匀，可缩短预湿时间。适用于种子直接浸入水中，不会造成组织破裂的种子。包括水稻、 麦类、玉米等。浸种温度一般采用20℃～30℃水温。

具体种类和浸种时间见《农作物种子四唑染色技术规定》。 3、染色前的种子处理

种子在染色前需将胚的主要构造和活的营养组织暴露出来， 利于四唑溶液渗透，便于正确鉴定。

（p63 图5－1）表明种子不同切法的部位，常见的有以下几种： （1）不须样品准备：

a、种皮渗水性良好的小粒豆类种子（如紫花苜蓿和小扁豆等），染色时就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在染色后剥去种皮就可正确鉴定。这类种子不须样品准备。

b、大粒豆类：可采用缓慢吸湿后不须样品准备。（如菜豆和大豆等）

但在染色后观察鉴定前也需剥去种皮，以便鉴定更为可靠。 （2）沿胚纵切取半粒：适用于具有直立胚的大粒禾本科种子。

如玉米、麦类和水稻等种子。

方法：沿胚纵切，使胚的主要构造暴露出来，取其一半用于染色观察。 （3）剥去种皮：棉花、十字花科种子需剥去种皮或内膜；

瓜类也剥去种皮。

方法是：将预湿后的整个种皮剥去。 4、四唑染色

将处理好的种子放在小烧杯内，然后加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移至一定温度的黑暗恒温箱内进行染色反应。 染色时间：因种子种类、样品准备方法、生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH值和温度等因素的不同而有差异，其中温度影响最大。

在20～45℃范围内，温度每增加5℃，其染色时间可减少一半。

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例如：30℃适宜染色时间为6h，

35℃则只需染色反应3h，

40℃下仅需1.5h。 一般选择35℃ 35℃染色：玉米、麦类等禾谷类种子0.5～1h

豆类种子 3～4h 剥去种皮染色的种子 2～3h

具体见《农作物种子四唑染色技术》。

达到规定时间或染色已很明显时，倒去四唑液，用水冲洗。如果到达规定时间种子染色仍不够完全，可适当延长染色时间。 5、鉴定前处理 书上复杂

不进行处理的种子，观察前要适当处理使胚部暴露出来，具体处理方法规程中都有：（读本p201-204） 如一些小粒豆类、棉籽沿胚中轴纵切； 瓜类除去种皮和内膜；

大粒豆类（大豆、菜豆、花生）：除去种皮，掰开子叶，露出胚芽。

大粒种子可直接用肉眼或放大镜观察； 小粒种子最好用10～100倍体视镜观察。 6、观察鉴定

测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验等综合运用能力。

观察鉴定的主要目的是区别有生活力和无生活力种子。 （1）一般鉴定原则：

a、凡是胚的主要构造染成鲜红色，为有生活力种子。 b、凡是胚的主要构造局部不染色，不染色部分超过允许范围， 为不正常种子。 c、凡是完全不染色的为死种子。

不正常种子和死种子均作为无生活力种子。

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（2）观察的部位：

①禾谷类：主要观察胚芽、胚轴、胚根、盾片。鉴别标准： 除完全染色的为有生活力种子外，下列有残缺的种子也有生活力： a、盾片上部或下部任一端不染色的部分＜1/3

b、胚根的顶端：玉米1/3不染色；水稻、高粱2/3不染色； 麦类大部分不染色，但不定根的原始体须染色。

理解：胚芽必须染色，胚根不染色可以长出次生根。 ②豆类：有生活力的种子允许不染色的最大面积： a、胚根顶端不染色：花生为1/3；蚕豆为2/3；其他为1/2. b、子叶顶端不染色：花生为1/4；蚕豆为1/3；其他为1/2. c、胚芽顶端不染色1/4，蚕豆除外。 ③瓜类：胚根顶端不染色允许1/2；

子叶顶端不染色允许1/2。（胚芽必须染色）

④其他种属：（棉属、芸苔属等）

胚根顶端1/3不染色；

子叶顶端1/3不染色。（胚芽必须染色）

P70 图5－2 小麦种子四唑测定结果的鉴定标准（单子叶）：

图中黑色部分表示染成红色，有生活力组织，白色部分表示不染色的死组织。 1－6有发芽力： 1．整个胚染成鲜红色；

2～5．盾片末端不染色；

6．胚根尖端不染色；

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7－16无发芽力：

7．胚根3/4以上不染色 8．胚芽不染色；（一点也不行） 9．盾片中部和盾片节不染色； 10．胚轴不染色； 11．盾片末端和胚芽尖端不染色; 12．胚的上半部不染色； 13．盾片不染色； 14．盾片、胚根和胚根鞘不染色； 15．染成模糊的淡红色； 16．整个胚不染色。

图5-3 大豆种子四唑测定结果的鉴定结果标准

1－3有发芽力：1．胚染成鲜红色；

2．仅子叶远离胚芽部分少量未染色;

3．仅子叶下部和边缘少许不染色； 4－6无发芽力：

4．子叶上部重要部位未染色；（面积少也不行）

5．胚根主要部位不染色； 6．子叶一半以上未染色。

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表1 农作物种子四唑染色技术规定

种名 预湿方式及时间h 小麦 大麦 黑麦 纸间或水中30°C恒温水浸种3-4h，或纸间12h 同上 a.纵切胚和四分之三胚乳。 b.分离带盾片的胚 纵切胚和大部分胚乳。 纵切胚和大部分胚乳 染色前的准备 35℃鉴定前的染色度 处理 时% 间，h 0.1 0.5-a.观察切1 面 b.观察胚和盾片 浓0.1 同上 观察切面 观察切面 有生活力种子允许不染色、较弱或坏死的最大面积 a.盾片上下任一端三分之一不染色。 b.胚根大部分不染色，但不定根原始体必须染色 胚根；盾片上下任一端三分之一不染色 a.胚根顶端三分之二不染色。 b.盾片上下任一端三分之一不染色 胚根顶端三分之二不染色 盾片中央 有不染色 组织，表 明受到热 损伤 同上 备注 玉米 高粱 同上 0.1 同上 水稻 纸间或水中 纵切胚和四分之12 三胚乳 纸间 12 0.1 同上 观察切面 棉花 菜豆 豌豆 绿豆 花生 大豆 豇豆 扁豆 蚕豆 南瓜 丝瓜 黄瓜 西瓜 冬瓜 苦瓜 甜瓜 白菜型油菜 不结球白菜 结球白菜 甘蓝型油菜 甘蓝 花椰菜 萝卜 芥菜 葱属（洋葱、韭菜、葱、韭葱、细香葱） 纸间6-8 a.纵切二分之一0.5 2-3 种子。 b.切去部分种皮。 c.去掉胚乳遣迹 无须准备 1.0 3-4 纵切 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶表面有小范围的坏死或子叶顶端三分之一不染色 a.胚根顶端不染色，花生为三分之一，蚕豆为三分之二，其他种为二分之一。 b.子叶顶端不染色，花生为四分之一，蚕豆为三分之一，其他为二分之一 c.除蚕豆外，胚芽顶部不染色四分之一 a.胚根顶端不染色二分之一。 b.子叶顶端不染色二分之一。 必要时可 除去内 外稃 有硬实应 划破种皮 切开或除去种皮，掰开子叶，露出胚芽 纸间或水中在20-30°C水中浸6-8h或纸间24h a.纵切二分之一种子。 b.剥去种皮。 c.西瓜用干燥布或纸揩擦，除去表面粘液 1.0 2-3h除去种皮，但和内膜 甜瓜1-2h 纸间或水中 a.剥去种皮。 1.0 30°C温水b.切去部分种皮。 中浸种3-4h或纸间5-6h 2-4 a.纵切种子使胚中轴露出。 b.切去部分种皮使胚中轴露出 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶顶端有部分坏死。 纸间12 a.沿扁平面纵切，0.2 0.5-但不完全切开，基1.5 部相连。 b.切去子叶两端，但不损伤胚根及子叶。 a.扯开切a.种胚和胚乳完全染色。 口，露出b.不与胚相连的胚乳有少量不胚。 染色 b.切去一薄层胚乳，使胚露出 - 11 -

辣椒 甜椒 茄子 番茄 纸间水中在20-30°C水中3-4h，或纸间12h a.在种子中心刺0.2 0.5-破种皮和胚乳。 1.5 b.切去种子末端，包括一小部分子叶 a.纵切种子一半，并撕开胚乳，使胚露出。 b.切去种子末端四分之一或三分之一 无须准备 0.1-0.5 芫荽 芹菜 胡萝卜 茴香 水中 在20-30°C水中3h 苜蓿属 草木樨属 紫云英 莴苣 茼蒿 水中22 0.5-1.0 a.撕开胚乳，使胚露出。 b.纵切种子使胚露出 6-24 a.进一步撕开切口，使胚露出。 b.纵切种子露出胚和胚乳 6-24 除去种皮使胚露出 胚和胚乳全部染色 胚和胚乳全部染色 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶顶端三分之一，如在表面可二分之一不染色。 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶顶端二分之一表面不染色，或三分之一弥漫性不染色 水中在30°C水中浸2-4h a.纵切种子上半0.2 部（非胚根端）。 b.切去种子末端包括一部分子叶 2-3 向日葵 水中3-4 纵切种子上半部或除去果壳 a.除去盖着种胚的帽状物。 b.沿胚与胚乳之界线切开 a.在胚与胚乳之边界刺破种皮。 b.在胚根与子叶之间横切。 1.0 3-4 a.切去种皮子叶使胚露出。 b.切开种子末端轻轻挤压，使胚露出。 除去果壳 甜菜 水中18 0.1-0.5 24- 48 扯开切口使胚露出 a.纵切种子，使胚露出。 b.掰开切口，使胚露出。 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶顶端表面二分之一不染色。 a.胚根顶端三分之一不染色。 b.子叶顶端三分之一不染色。 菠菜 水中3-4 0.2 0.5- 1.5 同上

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7、结果计算与处理

根据样品胚部的显色情况，分别计算各重复有生活力种子的百分率。 GB/T3543.7-1995对试验样品的规定至少200粒：即2～4次重复。 查重复间的最大允许差距: X1 X2 X3 X4→求平均数X （GB：但生活力有二、三次重复值；而发芽试验无二、三次重复值） X最大－X最小与容许差距比较：＞容许差距重作；

≤ 容许差距结果正确用X表示。

【例】测某种子生活力，三次重复95％、96％、98％。

X＝96.3％；98－95＝3＜容许差距7。

若测二次重复：95％、99％。X＝97％ 99－95＝4＜容许差距6。

表2 生活力测定重复间的最大容许差距 GB/T3543.7-1995 平均生活力百分率% 1 99 98 97 96 95 93-94 91-92 90 89 88 87 84-86 81-83 78-80 76-77 73-75 71-72 69-70 67-68 64-66 56-63 55 51-54 2 2 3 4 5 6 7-8 9-10 11 12 13 14 15-17 18-20 21-23 24-25 26-28 29-30 31-32 33-34 35-37 38-45 46 47-50 4次重复 5 6 7 8 9 10 11 12 12 13 13 14 15 16 17 17 18 18 18 19 19 20 20 重复间容许的最大差距 3次重复 - 5 6 7 8 9 10 11 11 12 12 13 14 15 16 16 16 17 17 17 18 18 18 2次重复 - - 6 6 7 8 9 9 10 10 11 11 12 13 13 14 14 14 15 15 15 15 16

（五）注意事项：

纵切禾谷类种胚时，一定要沿胚中部纵切，使切面显示胚的各部分构造，否则会出现鉴定误差。

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1、若切面不正

若保留大的：胚芽是完整的，染色时间短，胚芽可能不染色。

其他地方染色均匀，也属正常有生活力的种子。

若保留小的：胚芽与盾片有缝，只要其他部分染色深、均匀，

也有生活力。

2、切面粗糙：

切时剥开，部分细胞被撕开，细胞被破坏，表层细胞不染色。 所以切面要光滑。这时染成乳白色与不染色是有区别的。

（p71离体胚培养法:主要测定发芽缓慢或休眠期长的种子生活力，

主要用于林木种子，农作物种子用的少。）

四、染料染色法 （GB中无，了解） 同p73

(一)测定原理 （TTC法：活细胞染成红色；本法相反：活细胞不染色） 有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染料后，染料大分子不能进入活细胞内，其胚部活组织不能被染料染色；而死的种胚原生质膜丧失选择吸收能力，故可被染料染色。 (二)测定方法 1、靛蓝染色法

适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。试剂为靛蓝：蓝色粉剂，能缓慢溶于水。 测定方法如下： (1)种子预处理：（100粒×2次）

先将种子去壳，浸入30℃水中，充分吸账。 浸种时间：小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h，

燕麦、芝麻等4h； 油菜、花生、棉籽等6h，

蓖麻、红麻、大麻等7h；黍8h；水稻12h；玉米20 h。

然后，禾谷类沿胚中线纵切；双子叶种子剥去种皮，以备染色用。

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(2)靛蓝染色：

将处理好的种子置于小烧杯内，加入靛蓝溶液淹没种子。 浓度：纵切种子用0.1％溶液，剥去种皮种子用0.2％溶液。 染色时间:禾谷类为15min，

油菜、芝麻、红麻和大麻等30 min，

大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60 min， 豌豆3h。

(3)观察鉴定：取出种子，用清水冲洗后立即进行观察鉴定。 凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的，

为有生活力种子；

凡种胚全部染成蓝色的，或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染成

蓝色的，为无生活力种子。 2．红墨水染色法

测定原理、种子预处理、染色时间等与靛蓝染色法基本相同。 不同点：染成的颜色不同，死胚染成红色，活种子胚不染色。 测定时用刚开瓶的红墨水，红墨水与水的比例：

小麦、玉米、大豆和棉花等为1：60；大麦以1：120为宜。 到达规定染色时间后取出种子，用清水冲洗，立即鉴定。 五、软X射线造影法 （检验员读本无）

《1996国际种子检验规程》增加了X射线测定技术，国内没列入国标（国标为93规程）。

软X射线波长较长，为0.0l～0.05nm，穿透力弱。 （机械工业部）湘西探伤厂产的HY-35型农用X光机。 主要用于：作物种子成熟度的观察（水稻、花生） 种子隐蔽害虫的检验（进口林木种子隐蔽害虫） 农作物种子生活力测定（软X射线渗钡造影法）

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(一)测定原理

活细胞的原生质膜具有选择透性，而死伤组织丧失选择透性。 用氯化钡（BaCl2）溶液浸种渗透后：

凡有生活力的种子不吸收钡（Ba＋＋）离子； 无生活力的种子钡（Ba＋＋）就会渗入种子细胞内部。 软X射线造影时，由于重金属离子能强烈吸收x射线： 把这种渗钡状况不同的种子置于软X光机曝光造影： 在荧光屏上（印成相片后）：

死伤组织，渗入钡离子吸收了X射线，较为黑暗； 活种子较为明亮。

在底片上相反：死组织较透明；而活组织较为黑暗。 (二)测定方法 1．种子预湿

随机数取净种子200粒，每重复50粒。在室温下清水中浸泡2～16h充分吸账；对直接浸水容易破裂的种，可先进行缓慢预湿后再浸泡16h，然后取出种子用滤纸吸去种子表面的水分。 2．造影剂处理

凡不能透过活细胞的半透膜，而又能渗入死细胞内部的重金属盐类，均可作为造影剂。

常用的造影剂是BaCl2:造影效果好；价格便宜；使用方便。 将预湿好的种子放入20％的BaC12溶液中，处理时间一般为1～2h。 （玉米粒大为2.5h,小麦1.5h，番茄、黄瓜、西瓜1h）。注意： 应严格掌握BaC12浸种时间，过长、过短都会影响测定的正确性。 将种子取出放入网兜，用自来水冲洗，再用吸水纸吸干种子表面的水分，或将种子于60～70℃下干燥1h。

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3．软x射线摄影:可进行透视摄影；或荧光观察（仅限于大粒种子）。

我国主要应用Hy—35型农用x光机。

曝光条件：电压（kv）=30千伏，电流（mA）=3毫安。 曝光时间：小麦、水稻20秒；棉花40秒。 照射剂量和透过率太大，反差不明显，影像不清晰。

照射剂量太少，不同厚度的组织均不能通过，没有产生造影效果。 因此，必须在实际测定中确定最佳摄影条件。

常用胶片有：国产8DIN（定）黑白片，经济适用、可放大，可印相。

X光胶片最好，但太贵；

也可用4号相纸（GB21）直接印相，可供自己看。

摄影时，在暗室内剪取适当大小的胶片，装入黑纸袋内，置于摄影台上，将种子放在黑纸袋上排好摄影。 4．影像鉴定

在暗室用D-72显影液显影和酸性定影液定影。 鉴定原则：

在照片上（荧光屏上）：种胚黑色的，为无生活力种子；

种胚白色的，为有生活力种子。

在胶片上（底片上）：种胚透明的，为无生活力种子；

种胚黑色的，为有生活力种子。

总之，软x射线造影技术具有多方面的用途：

① 既能测定种子生活力，不受种子休眠限制。与四唑相比， 具有不破坏性样品的优点。

②也能观察种子内部害虫和机械损伤，区分饱满与空瘪、虫蛀等。 技术熟练时，诊断的有生活力种子与发芽率r=0.995. 特别适用于：番茄、西瓜和黄瓜等扁平种子生活力分析。 本节重点：种子生活力的概念；四唑染色技术的原理。

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第二节 种子活力测定原理及方法

种子活力（seed vigor）是种子质量的重要指标之一，与种子田间出苗质量密切相关。活力测定经过几十年的研究，已取得了重大进展。在美国和欧洲，许多种子公司把活力测定作为常规的检验项目，但国内没被列于国标。 一、种子活力的概念

种子活力的定义长期得不到统一，不同学者有不同的定义，经过27年的争论，直到1977年ISTA才确定了种子活力的定义：p75 1、种子活力是决定种子或种子批在发芽和出苗期间的活性水平和行为的那些种子特性的综合表现。表现好的为高活力种子，表现差的为低活力种子。

北美官方种子分析家协会(AOSA) 于1980年采用了较为简单定义：2、种子活力是指在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和 长成正常幼苗潜在能力的总称。

以上两个定义的基本内容是十分相似的。因为种子活力不像种子发芽那样是一个单一的测定特性，而是描述种子出苗不同方面（包括田间和贮藏期间）的综合特性。

2004年出版的《国际种子检验规程》将种子定义为： 3、种子活力是指在广泛的环境条件下，决定可接受发芽率的种子批的活性和性能那些特性的综合表现。

种子活力不是一种简单一的测定概念，而是一种能表达有关种子批性能多种特性的综合概念：

（1）种子发芽、幼苗生长速率和整齐度； （2）种子在不利环境条件下的出苗能力； （3）贮藏后，特别是能保持发芽力的性能。

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高活力种子批即使在不适宜的环境条件下，仍具有良好性能的潜力。

高活力种子发芽、出苗整齐、迅速，对不良环境抵抗力强。 低活力种子，在适宜条件下虽能发芽，但发芽缓慢，在不良环境条件下出苗不整齐，甚至不出苗（如陈种子发芽率虽正常，但早春播种出苗率低）。

二、种子活力测定的重要意义（同读本；颜启传） 1、高活力种子的生产优越性

高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力。

(1)提高田间出苗率：高活力种子播到田间后出苗迅速，均匀一致，保证苗全苗壮和作物的田间密度，为增产打下良好的基础。 (2)抵御不良环境条件：

高活力种子由于生命力较强，对田间逆境具有较强的抵抗能力。如干旱地区，高活力种子可适当深播，并有足够能量顶出土面；

而低活力种子在深播情况下无力顶出土面。

(3)抗寒力强，适于早播：

春天种糯玉米，为了及早上市，一般提早播种（4/5～10覆膜），高活力种子对早春低温条件具有抵抗能力。蔬菜早种可早上市，提高经济效益。 (4)节省播种费用：

高活力种子可减小播种量，特别适于机械精量播种。（玉米可单粒播种：先玉335、4400粒/亩）

低活力种子往往缺苗断垄，必须重播，增加种子费用； (5)增加作物产量：

据美国对大豆、玉米、麦类等14种作物的统计，高活力种子可以增产20～40％。对于叶菜类和根菜类蔬菜作物，高活力种子营养器官生长迅速，增产作用更加明显。

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(6)提高种子耐藏性：

高活力种子可以抵抗高温、高湿等不良条件。长期贮藏的种子，最好选择高活力的种子 2、种子活力测定的必要性

(1)活力测定是保证田间出苗率和生产潜力的必要手段。

播种之前，进行活力测定，选用高活力种子，防止采用发芽率高而活力低的种子给生产带来损失，特别进行机播(穴播)时尤为重要。 (2)活力测定是种子产业中必不可少的环节。

种子收获后，要进行干燥、清选、加工、贮藏等过程。如某些条件不合适，可能使种子遭受机械损伤，使种子变质而降低种子活力。 （烘干的安全温度：种温43℃；2％水分/h）。及时进行活力测定， 可及时改善种子加工、处理条件，保持和提高种子活力。 (3)活力测定是育种工作者必须采用的方法。

活力测定有助于育种工作者在选择抗寒、抗病、抗逆、早熟、丰产的作物新品种。

三、活力、生活力和发芽力的区别与联系

衡量种子生理质量有发芽力、生活力和活力三个指标，三者有密切的关系，却有完全不同的含义：

1、种子生活力：是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。

通常用供检样品中活种子数占样品总数的百分率。

2、种子发芽力：是指种子在适宜条件下(实验室控制条件下)长成

正常植株的能力。通常用供检样品中长成正常幼苗数占样品总数的百分率，即发芽率表示。

在下列情况下，如果鉴定正确，生活力测定与发芽率测定结果 基本是一致的：

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①无休眠、无硬实或破除了休眠和硬实。 ②没有感染病害。

③在加工时未受到不利条件或贮藏期间未用有害化学药品处理。 ④尚未发生萌芽。

⑤发芽试验中未发生劣变，且发芽试验是在适宜条件下进行的。 发芽率已作为各个国家种子质量的主要指标。但由于生活力快速， 有时可用来替代来不及发芽的发芽率，但最后的结果还是用发芽率作为正式的依据。

3、种子活力就是指高发芽率种子批间在田间表现的差异。

种子活力是比发芽率更敏感的指标，在高发芽率的种子批中， 仍然表现出活力的差异（高低）。通常发芽率高的种子具有较高的活力，但两者不存在正相关。

四、种子活力测定方法分类 （p75）

种子活力测定方法达数十种，其分类方法有多种，一般分为： 直接法和间接法。

直接法：在检验室条件下模拟田间不良条件测定田间出苗率的方法。如低温处理是模拟早春播种期的低温条件。 砖砂试验是模拟田间板结土壤或粘土地区条件

间接法：在检验室内测定与田间出苗率（活力）相关的生理生化指标。如浸泡液电导率、加速老化试验等。

现将ISTA和AOSA（北美官方种子分析家协会）的活力测定方法简介如下： 1、ISTA活力测定方法（《活力测定方法手册》，1995版) (p75): 第一类是推荐的2种活力测定方法：电导率测定和加速老化试验； 第二类是建议的7种活力测定方法：冷冻测定、低温发芽试验、控制劣变试验、复合逆境活力测定、砖砂试验、幼苗生长测定和四唑测定。

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2、AOSA活力测定方法（《活力测定手册》， 广泛应用的方法，将种子活力测定分为3种类型：

逆境测定（加速老化试验、低温试验、冷发芽试验）； 幼苗生长和评定试验（幼苗活力分级、幼苗生长速率测定）； 生化测定（四唑法、电导率法）。 该分类体系被广泛接受。

现将常用的种子活力测定方法分类介绍如下： 五、种子活力测定方法： （一）发芽测定法

这类测定方法是根据高活力种子幼苗生长快、幼苗健壮、生长正常、幼苗株大和重量较重等生长特性，来评定种子生活力水平的方法。 而低活力种子则相反。

1、标准发芽试验法测定（发芽速率测定）

是一种最古老和最简单的方法，适用于各类作物的活力测定。 方法是：采用标准发芽试验，每日记载正常发芽种子数。发芽结束时，

测定正常幼苗长度或重量。然后按公式计算各种活力指标。

(1) 初期发芽率测定：

小麦、大豆、玉米等采用计算3d发芽率（正常4d计算发芽势，玉米3d即出苗为高活力种子：1cm±）；也可采用计算发芽势的方法。 (2)发芽日数测定：

发芽达90％所需日数：日数少活力高。

或发芽达50％所需日数：适用于发芽率较低的种子样品。 (3)发芽指数测定：每天发芽种子数（Gt），同其相应发芽天数（Dt）

之比的总和。

发芽指数(GI)＝∑（Gt/Dt）

式中：Gt为在不同时间的发芽数。Dt为相应的发芽日数。∑为总和。

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测定结果GI值与活力成正相关关系。

如玉米60/3+20/4+10/5=27; 60/3+30/4=27.5。数值越大：天数越少。 （4）活力指数测定：发芽指数(GI)与幼苗长度（cm）或重量（g）

之积。

活力指数(VI)＝GI×S

式中：S为一定时期内幼苗长度(cm)或幼苗重量(g)，

GI为发芽指数。

(5)简易活力指数测定：适用于发芽快速的作物种子，如油菜等。 简易活力指数（SVI）＝G×S

式中：G为发芽率，S为幼苗长度(cm)或重量(g)。 (6)平均发芽天数(MLIT)测定： 平均发芽天数＝∑(Gt×Dt)/∑Gt 式中：Gt、Dt与发芽指数公式中相同。

平均发芽日数常用来表示发芽速率，平均发芽日数越少，发芽 速度越快。 2、幼苗生长测定：

适用于具有直立胚芽或胚根的禾谷类和蔬菜类种子。

主要测定胚芽或胚根的平均长度作为禾谷类和蔬菜种子的活力测定方法。 测定方法：

①取4份试样，每份25粒种子。

②每份取发芽纸3张(30×45cm)，取其中1张画线，先在纸长轴中心画一条横线，距顶端15cm。并在其上、下每隔1cm画平行线。 ③在中心线上每隔1cm标一个点，共25个点，每点上放一粒种子。胚根部朝下，再盖2层湿润发芽纸。纸的下部向上折叠2cm，将纸松卷成4cm直径的筒状，用橡皮筋扎好，将纸卷竖放在容器内，上用塑料袋覆盖，

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④置于黑暗恒温箱内培养7d（规定的温度），然后统计苗长： ⑤计算每对平行线之间的胚芽尖端的数目。 ⑥按下列公式求出幼苗平均长度：

胚芽平均长度（cm) L＝（n1x1+n2x2+…+n15x15）/N 式中：n为每对平行线之间的胚芽尖端数（种子数）；

x为中点至中线之间的距离(cm)。依次为0.5、1.5、2.5、3.5、

4.5、5.5等

N：正常幼苗总数。

发芽试验中不正常幼苗不统计长度。

此法在实际应用中，也可不画线：发芽试验结束时，直接用直尺测量每株幼苗的胚芽或胚根的长度，最后求平均值。 注意问题：

①幼苗生长速度在不同品种间存在差异，结果的比较应在同一品种进行。如玉米：65232、齐319作母本的较高：DH11、LD981等。 ②种子发芽速率受到原始水分的影响，测定前应将过湿或过干的种子平衡至相近的含水量。 3、幼苗评定试验

适用于大粒豆类种子。这些种子不能用幼苗长度表示活力。 因其细弱苗可达相当的长度。此法是采用标准发芽方法，幼苗评定时分成不同等级。

例如，豌豆种子试验方法如下：

取4份试样，每份50粒。砂床发芽，于20℃、相对湿度95～98％、光照12h、光强度12000Lx培养6d，取出幼苗洗净，进行幼苗评定，先将种子分成发芽和不发芽两类．再将幼苗分成三级： (1)健壮幼苗：胚芽强壮、深绿色。初生根强壮或初生根少

而有大量次生根。

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(2)细弱幼苗：胚芽短或细长。初生根少或较弱，但属正常幼苗； (3)不正常幼苗：根或芽残缺或根芽破裂、苗色褪绿等。 第一级为高活力种子。第二级为低活力而具有发芽力的种子．

将第一、二级相加即为种子发芽率。

总结：发芽速率测定、幼苗生长测定、幼苗评定试验，均采用标准

发芽试验，必须严格控制发芽温度、湿度和光照条件，否则易造成误差。 （二）、逆境试验测定

根据种子在逆境条件下，抗逆能力强．经逆境处理仍能保持较高发芽力，幼苗生长正常的，为高活力种子。反之，为低活力种子。 1、抗冷测定(cold test)：

适用于春播喜温作物种子，如玉米、棉花、大豆等。

而秋播作物种子（小麦、大白菜、油菜），发芽时具有忍耐低温的能力，故不宜应用此法。 （1）测定原理

该法是将种子置于低温和潮湿的土壤中，处理一定时间后，移至适宜温度下生长，模拟早春田间逆境条件，观察种子发芽成苗的能力。 抗冷测定通常采用土壤卷法和土壤盒法。其中土壤盒法较为简单。 （2）测定方法――土壤盒法

取种子50粒，重复4次，播于装有3～4Cm深的潮湿土壤盒内，盖土2cm，在10℃的低温下处理7d，移入适宜温度下培养。 玉米、水稻于30℃条件下经3d；大豆、豌豆于25℃条件下经4d；

计算发芽率：凡正常幼苗作为高活力种子计算。 此法手续简单，但所占空间较大。

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2、低温发芽试验(cool germination test) （1）、测定原理

主要适用于棉花，也可用于高梁、黄瓜、水稻等。棉花早春播种常遇低温，会引起胚根损伤，下胚轴生长速率降低。棉花发芽最低 温度一般为15℃，本法采用18℃低温模拟田间低温条件。 （2）测定方法： 试验方法与标准发芽试验基本相同。

种子置砂床后于18℃、黑暗条件下发芽6d(硫酸脱绒)

或7d(末脱绒)，

检查幼苗生长情况，凡苗高(根尖至于叶着生点的距离)达4cm以上的即为高活力种子。

3、加速老化试验(accelerated ageing test，以下简称AA测定) 目前加速老化试验主要用于两方面：一是预测田间出苗率；

二是预测种子的耐藏性。

（1）测定原理： 此法适用多种作物。

采用高温(40～50℃)、高湿(100％相对湿度)处理种子，可加速种子老化。高活力种子经老化处理后仍能正常发芽，低活力种子则产生不正常幼苗或全部死亡。

（2）、测定方法：以大豆种子为例

将种子200多粒置于老化内箱的支架上，箱内加水，水面距支架6－8cm，然后加盖密封，置于41±0.3℃的水浴恒温箱内(外箱)， 关闭外箱密闭72h，取出种子用风扇吹干，进行发芽试验。

取50粒，4次重复，按标准发芽试验方法进行发芽，将长出正常幼苗种子作为高活力种子。此法还适用于其他作物种子。

不同作物种子老化温度和时间见表5—4。

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表5—4 不同作物种子AA测定老化条件

作 物(括号内为老化后种子水分％) 老化温度,℃ 老化时间,h 推荐：大豆（27-30） 41 72 建议：苜蓿(40-44),菜豆(28-30),油菜(39-44),甜玉米(31-35) 41 72 莴苣(38-41),洋葱(40-45),红三叶(39-44),高羊茅(47-53) 番茄(44-46),小麦(28-30) 高粱(28-30),烟草(40-45) 43 72 玉米(26-29) 45 72 绿豆(27-32) 45 96 《活力测定方法手册》(1STA，1995年)对老化后种子水分也 有所限制：老化后发芽前，取出10－20粒称重，测种子水分。 如大豆要求27～30％。如果种子水分低于或高于所规定值，则试验结果不准确，应重作试验。

4、控制劣变测定（适用于小粒蔬菜种子） （了解）

其原理和加速老化试验相似，但对种子水分及老化的温度要求 更加严格。 具体方法为：

首先测定种子水分。取400多粒种子样品称重后置于湿润的培养皿内，让其吸湿至规定的水分(用称重法计算种子水分)：白菜、胡萝卜、糖用甜菜为24％；甘蓝、花椰菜、莴苣、萝卜为20％；洋葱为19％；红三叶为18％。用称重法检查种子水分。达到规定要求后将种子放入密封的容器中，于10℃过夜，使种子水分均匀分布。

然后将种子放入铝箔袋内，加热密封，置于45℃水浴槽中的金属网架上，经24h后取出种子，进行标准发芽试验。种子胚根露出即作为发芽，发芽率高者活力也高。

此法与田间出苗率有明显相关，且重演性好，但仅适用于小粒种子。 5、希尔特纳试验（又称砖粒试验） （1）、测定原理

主要适用于谷类作物种子。模拟粘土或板结土壤的机械压力，受损伤

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或带病及低活力种子，芽鞘顶出砖粒能力弱；高活力种子项出砖粒能力强。

（适用于粘土地区或雨后土壤板结情况，不适用于土壤疏松地区） （2）、测定方法 小麦砖粒试验方法如下：

先将砖块压碎磨成颗粒为2～3mm的砖粒(或用2～3mm的粗砂代替)，清洗、消毒、加水使砖粒湿润，每1100g砖粒加水250mL，搅匀放l h，然后放入10×10×8.5cm的方盒内，厚度3cm。取种子100粒（2～4次重复），均匀播在砖粒上，并盖3～4cm厚的湿砖砾，加盖，于20℃黑暗条件下培养10～14d，统计正常幼苗数，并计算活力百分率。

缺点：此法因砖粒供应困难、操作麻烦、重演性不太好等原因，应用有一定局限性。

（三）、生理生化测定－主要讲电导率测定

《国际种子检验规程》的电导率测定适用于豌豆种子。 ISTA活力手册指出也适用于大豆、菜豆、玉米、棉花、番茄和洋葱等种子。已在欧洲、澳大利亚、新西兰和北美得到广泛使用。电导率测定也是目前唯一被列入ISTA规程的种子活力测定方法。 1、测定原理

高活力种子细胞膜完整性好，浸入水中渗出的可溶性物质或电解质少，浸出液的电导率低。电导率与田间出苗率呈负相关（即电导率高，田间出苗率低），可用电导率的高低判别种子活力的高低。 2、测定方法：豌豆种子电导率测定的经典方法如下： （1）取50粒种子称重(精确至2位小数)，2个重复。 （2）取直径为80mm的烧杯3个，用热水和无离子水洗净。 （3）将种子放入烧杯内，加250 ml无离子水，另一烧杯内加无离子水作对照（烧杯须用薄膜盖好，以减少水分蒸发和被灰尘污染）。 于20℃浸泡24h。用电导仪测定浸泡液和对照的电导率（盛种子的烧

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杯应轻微摇晃10～15s，电极插入溶液，注意不要把电极放在种子上）。

电导率是电阻率的倒数，国际单位微西门子(μS)。

将各重复样品电导率减去对照电导率，求出2个重复的平均电导率： 单位重量电导率（μS／cm·g) ＝

重复Ⅰ电导率-对照电导率

重复Ⅰ种子重

2个重复电导率差值＞4时，应重做试验； 当结果高于30时，则容许差距为5。 3、注意事项

电导率受许多因素，如种子大小及完整性、种子水分、浸泡温度及时间、容器大小、溶液体积等影响，应予注意。 （1）测定最好使用去离子水(20℃下电导率≯2μS／cm)；

也可用蒸馏水(20℃下电导率≯5μS／cm)。

（2）所有电导率都应在20℃条件下测定。因为温度变化会导致电导

率的差异。

（3）在测定前测定种子水分，应在浸种前将其水分调至10～14％。 4、结果说明解释

根据电导率测定结果，即用活力水平对种子批进行排列。 英国已在豌豆上应用多年总结如下经验：

豌豆种子电导率值的解释

电导率 （μS/cm.g） 结果解释 ＜25 在不利条件下也适合于早期播种或适时播种。 25～29 种子可适用于早期播种，但在不利条件下可能有出苗率差的风险。 30～43 不适用于早期播种，特别在不利条件下。 ＞43 种子不适用于适时播种。 复习题：1、四唑染色技术的原理是什么？

2、种子生活力、活力、发芽力的区别与联系。

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