光合细菌规模生产工艺研究

·研究报告·

光合细菌规模生产工艺研究

许进香　颜立成

(中国人民解放军军需大学军事兽医研究所　长春　130062)

　　摘　要　报道了大量培养光合细菌的密封式生物反应器的设计和制造,温度与流动培养采用自动化控制,能进行规模化生产。对培养基中的碳源、氮源、矿物质元素及生长因子进行了最适添加量试验,其中以酵母浸膏促生长作用最明显,对碳源的利用以葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、甘露糖醇、烟酸、酒石酸较好,对氮源的利用氯化铵最好,硫酸铵次之。乙酸钠、氯化铵、硫酸锰、硫酸铁、氯化钴的最适添加量分别为1.75g/L、0.75g/L、25μg/L、25mg/L、2.75mg/L。最适培养环境:光照强度为5000lx、温度为30～34℃,pH值为7.0～7.5。添加絮凝剂使光合细菌自然沉淀,简化了工艺流程,细胞密度达到1.5g/L,而国外报道是1.3g/L。

关键词　光合细菌;生产工艺;生物反应器;絮凝剂;细胞密度。

　　近年来,由于蛋白质饲料资源的匮乏,生物添加剂的开发应用和水环境污染处理等问题,使人们注重了光合细菌规模生产工艺及应用的研究。

迄今为止,在工业上还没有大规模培养光合细菌的技术[1]。用于大量培养光合微生物的密封式生物反应器,国内尚未见报道,在法国和意大利,正在利用管形环状生物反应器进行中试生产。Shipman(1977年)报道了光合细菌在卧式透明的聚氯乙烯培养罐中培养

[2,3]

[2]

1.2　培养基

1.2.1　基础培养基　NH4Cl0.75g,NaHCO31g,K2HPO40.5g,CH3COONa1.75g,MgCl20.4g,NaCl2g,加蒸馏水1000ml。pH7.0～7.5,113℃

高压灭菌30min。

1.2.2　碳源　葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、甘露糖醇、烟酸、酒石酸、甘油、天冬酸、谷氨酸、琥珀酸、果糖、安息香酸、精氨酸、乙酸钠、丙酮酸、乙醇等均为分析纯。

氮源　氯化铵、硫酸铵、硝酸盐、尿素。矿物质元素　硫酸锰、硫酸铁、氯化钴。

培养基的最优化采用平行分批培养法,向一系列相同的培养基中分别加入不同量的特定营养物,进行平行的分批培养,测定最终的菌体浓度。当底物处于低浓度时,菌体浓度随底物浓度提高而相应提高,直至底物达某一值之后,菌体浓度不再升高时为止。

红螺菌科细菌对碳源的利用性,采用生长量测定的方法。以OD550直接记数和细胞干物质重量计算。

1.3　玻璃生物反应器

用10mm厚的玻璃制成40cm×50cm×100cm的容器,顶层有进料孔、排气孔、温度加热器孔,2侧端分别设有进水孔和出水孔,其间有密封的循环泵相连,温度加热器与循环泵均用继电器自动化调控,循环泵的流量为1m/h。1.4　工艺流程

试管一级种子培养※大方瓶二级种子培养※生物反应器培养※沉淀池※液体产品※检验※包装※出厂　　　　　　　　　　　　　↑

　　　　　　　　絮凝沉淀(胶胨状)

3

。Jǜttner等(1971

年)报道了光合作用的细菌在管道系统中连续培

养[3]。国内多用玻璃缸或塑料桶静置培养[4],也有用槽式装置作半开放或开放式培养

[5]

,易于造

成杂菌污染,且菌体得率低。用光合细菌处理废水,国内外均有报道(Soder和Pabst,1970;Pabst,

[6～8]

1975;朱章玉等,1991;朱核光等,1995),在此条件下,光合细菌总是同其它细菌一起生长的。本文报道在我国首次制成了用于大量培养光合细菌的密封式生物反应器,温度与流动培养采用自动化控制,能进行规模化生产,而且结构简单,成本低廉,适合于在养殖场推广应用,对生产工艺作了系统研究,包括菌种、培养基、发酵条件的控制、菌液浓缩及菌液分离技术,细菌密度达到1.5g/L。

1　材料与方法

1.1　菌株

将长春郊区稻田和河沟泥土放入灭菌的PBS基础培养液中,两周后,长成红色菌液,连续传3代后,进行形态鉴定,对碳源的利用性,与氧的关系、鉴别培养和DNA的G+C克分子百分含量的测定。

收稿日期:1999-05-10作者简介:许进香　女,高级实验师。现从事光合细菌的生产及微生物发酵饲料的开发研究。26微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷

1.5　菌液浓缩及分离技术

菌液浓缩是利用PSB的趋光性,附着于玻璃壁,将生物反应器中的菌液排去2/3,余下的1/3菌液混合刮取玻璃壁上附着的PSB,则为浓稠的

PSB浓缩液,镜检计数50亿以上/ml,排出的2/3液体加入絮凝剂聚丙烯酸钠150～200×10

-6

2.1.1　厌氧条件下细胞能进行光合异养代谢,菌液呈紫红色,细胞光合同化简单的有机物质,不能以硫化物作为唯一光合电子供体而生长。初步认为属于红螺菌科。将紫红色菌液进行形态鉴定,对碳源的利用性,与氧的关系、鉴别培养和DNA的G+C克分子百分含量测定,结果如表1。细胞的形态有(1)弧形或螺旋状;(2)球形、卵形、短或长杆状。(1)为红螺菌属,(2)为红假单孢菌属。2.1.2　根据红螺菌属内种的分类特征　培养物深红色,细胞宽0.7～1.0μm,兼性微好氧,可利用精氨酸、天冬氨酸和乙醇,为深红红螺菌(Rs.rubrum)。

培养物呈棕红色,细胞宽0.3～0.5μm,兼性好氧,可利用精氨酸,为纤细红螺菌(Rs.tenue)。

,将

pH调到4.0,加热到50℃5min以上,使菌体从液体中沉淀分离得胶胨状沉淀物。烘干后,菌体重量达1.5g/L。

2　结果与讨论

2.1　菌种的分离鉴定

按《伯杰细菌鉴定手册》第八版的分类体系,进行菌种的分离鉴定。

　　　　表1　　红螺菌科细菌的特性

　　　　Table1.　　PropertiesoftheRhodospirillaceae

碳　源安息香酸

利用不同碳源可以生长的菌株Rp.palustrisRs.fulvum

天冬氨酸

Rp.CapsuleteRs.rubrum

精氨酸

Rs.rubrumRs.tenue

柠檬酸

Rp.gelatinosa

细胞株的形状和大小/μm杆状、卵形0.6～0.9×1.2～2.0

螺旋

0.5～0.7×3.2～3.7

卵形到杆状0.5～1.2×2～2.5弧形到螺旋状0.8～1.0×1.5～2.5

弧形到螺旋状0.8～1.0×1.5～2.5

螺旋状

0.3～0.5×3.0～6.0

杆状直或稍弯0.4～0.5×1～2

甘露糖醇

Rp.sphaeroidesRs.photometricumRp.globiformis

烟　酸

Rp.sphaeroidesRp.sulfidophila

酒石酸

Rp.sphaeroidesRp.globiformis

甘油

Rp.palustrisRp.sphaeroides

球形

2～2.5×2.5～3.5

螺旋1.2～1.5×7～10

杆状

1.6～1.8球形

2～2.5×2.5～3.5

杆状、球形0.6～0.9×0.9～2.0

球形

2～2.5×2.5～3.5

杆状1.6～1.8杆状、卵形0.6～0.9×1.2～2.0

球形

2～2.5×2.5～3.5

棕色

63.4～69.9

棕红

兼性、好氧

64.3～66.3

紫红

66.3

棕色

兼性、好氧

63.4～69.9

黄棕

67.0～71.0

棕色

兼性、好氧

68.4～69.9

棕色紫红棕色

兼性、好氧

桃红色

兼性、微好氧

液化明胶不利用丙酸盐、甘露醇或山梨醇不利用丙酸盐可利用甘露醇或山梨醇66.3

65.868.4～69.970.5～72.4

棕红

兼性、好氧

64.3

深红

兼性、微好氧

63.8～65.8

深红

兼性、微好氧

可利用乙醇

63.8～65.8

黄褐黄棕

厌氧兼性、好氧

可利用单糖不利用乙醇

64.3～65.365.5～66.8

颜色厌氧培养棕红

兼性、好氧

不利用单糖

与氧的关系

鉴别培养

DNA碱基比/molG+C·dl-1

64.8～66.3

3期　　　　　　　　　　　　　　　　　　许进香等:光合细菌规模生产工艺研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　27

　　培养物呈黄褐色,细胞宽0.5～0.7μm,在好氧条件下不生长,为黄褐红螺菌(Rs.fulvum)。2.1.3　根据红假单胞菌属分类特征　培养物桃红色,细胞细杆状,0.5μm×1.2μm。菌液粘稠,液化明胶,能利用柠檬酸,不利用丙酸盐、甘露醇和山梨醇,为胶质红假单胞菌(Rp.gelatinosa)。在pH7以上的培养基中,细胞主要为球形,直径为0.7～4μm,可利用甘露糖醇、山梨醇、烟

酸、酒石酸和甘油,不利用丙酸盐,为球形红假单细胞菌(Rp.sphaeroides)。

2.1.4　DNA的G+C克分子百分含量是比较恒定的,在以上分离鉴定的基础上,可以较精确地鉴

定各种菌种。

2.2　培养基的选择和最优化

2.2.1　碳源对红螺菌科细菌生长的影响　用17种不同碳源作单一碳源,培养PSB结果见表2。

　　　　表2　　红螺菌科细菌在不同碳源上的生长情况

　　　　Table2.　　ThegrowthofRhodospitillaceaeinthemedincontainingdifferentcarbonsources

菌　　　　种

碳　源

荚膜

乙酸钠丙酮酸琥珀酸苹果酸柠檬酸酒石酸安息香酸乙醇甘油葡萄糖果糖甘露糖醇天冬氨酸谷氨酸精氨酸酵母浸膏烟酸

++++-----++-++-+d

胶质+++++d-+-+0±00-+-沼泽++++--+++----+-+-球形++++-+-+++++0--++

黄褐++++--++-d--d0-+-深红++++---+--+-++++-纤细++++---+-----0++-从长春郊区分离的菌种OD550

1.31.31.51.81.81.51.31.31.81.81.51.31.81.71.32.01.7

注:+能利用或需要;-不能利用或不需要;0未做试验;d按菌株种类而不同;±某些未能利用。

　　表2说明:从长春郊区分离的菌种对17种碳源均能利用,其中以酵母最好,苹果酸、柠檬酸、甘油、葡萄糖、天冬氨酸较好,谷氨酸、烟酸次之,对琥珀酸、乙酸钠、丙酮酸、精氨酸、安息香酸也能利用。添加甘油、葡萄糖、烟酸生长较好,说明含有大量的球形红假单胞菌。添加柠檬酸生长较好,表明含有较多胶质红假单胞菌。添加安息香酸能够生长,表明含有黄褐螺菌。添加精氨酸能够生长,表明含有深红螺菌和纤细红螺菌。

乙酸钠的最适添加量:乙酸钠来源广,价格便宜,以乙酸钠为碳源,其最适添加量如表3所示。表3表明,乙酸钠的最适添加量为1.75g/L。2.2.2　氮源对红螺菌科细菌生长的影响　红螺菌科细菌对氮化合物的利用范围,尚未见有系统的研究报告,本试验以NH4Cl、(NH4)尿素、2SO4、表3　红螺菌科细菌在含有不同浓度乙酸钠培养　　　基中的生长情况

Table3.　ThegrowthofRhodospitillaceaeinthe　　　medincontainingdifferentconcentration　　　　ofsodiumacetate

乙酸钠浓度/g·L-1

0.50.751.01.251.501.752.0

培养时间/d

14141414141414

OD5501.01.31.61.81.92.01.9

硝酸盐作为氮源,分别培养从长春郊区分离的菌种。其中,以氯化铵最好,硫酸铵次之,尿素和硝

酸铵则不能利用。

NH4Cl的最适添加量如表4。28微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷

表4　红螺菌科细菌在含有不同浓度NH4Cl培养　　　基中的生长情况

Table4.　ThegrowthofRhodospitillaceaeinthe　　　medincontainingdifferentconcentrationof　　　NH4Cl

NH4Cl浓度/g·L-10.50.751.01.251.51.752.0

培养时间/d

14141414141414

OD5501.52.01.91.81.71.61.5

表4表明,NH4Cl的最适添加量为0.75g/L。2.2.3　矿物质元素对红螺菌科细菌生长的影响　红螺菌科细菌对矿物质需要的研究已有报道,认为培养基中铁、锰可刺激细菌的生长,而钴与VB12合成有关

[3]

,本试验对锰、铁、钴作了最适添

加量试验,结果如表5。

　　表5表明,硫酸锰的最适添加量为25.6μg/L,FeSO4的最适添加量为25mg/L,CoCl2的最适添加量为1.4mg/L。

表5　红螺菌科细菌在含有不同浓度硫酸锰、硫酸铁和氯化钴培养基中的生长情况(培养时间为14d)

Table5.　ThegrowthofRhodospitillaceaeinthemedincontainingdifferentofMnSO4、FeSO4andCoCl2

MnSO4浓度/μg·L-1

1.63.2

6.412.825.651.2102.4

OD5501.55

1.621.841.952.01.621.5

FeSO4浓度/mg·L-1

12.525

50100200

OD5501.672.01.551.51.45

CoCl2浓度/g·L-1

0.72.8

2.85.611.222.4

OD5501.67

2.02.01.751.701.67

2.2.4　维生素对红螺菌科细菌生长的影响　红

螺菌科细菌要求多种生长因子,多为B族维生素,它们是各种酶的活性基的组成部分,对细菌的生理活动非常重要。本试验对酵母浸膏和烟酸作了最适需要量的测定,结果如表6所示。表6　红螺菌科细菌在含有不同浓度酵母和烟酸　　　培养基中的生长情况(培养时间为14d)Table6.　ThegrowthofRhodospitillaceaeinthemedincontainingofyeastextractandnicotinicacid

酵母浸膏浓度/g·L-1OD550

0.151.25

0.300.601.202.404.80

1.551.751.852.002.00

烟酸浓度/g·L-1

0.75

1.503.006.0012.0024.00

OD5501.501.701.902.001.701.67

光谱的波长为800～900nm,主要在红外区,用电

灯泡发光,即可满足其对光的要求。据测定,40～60W灯泡,10～25cm距离,光照强度为500～1100lx。本试验用200ml玻璃瓶静置培养时,一个60W灯泡约1000lx,可放置10瓶,约2万ml培养液,用210L玻璃生物反应器流动培养时,用5个60W灯泡,约5000lx。生物反应器培养的结果与大方瓶培养的结果基本一致。菌体密度达到1.95OD值,菌体收获量达10～15g沉淀物/L,约1.5g/L菌体干物质。

2.3.3　pH对红螺菌发酵的影响　本试验采用K2HPO4与KH2PO4缓冲液法,使培养液在发酵后的一星期内始终保持在7.0～7.4范围内,直至10d后pH值才升至8.5,用20%苹果酸滴加,调至7.0左右。pH值的变动范围较小,对红螺菌的生长没有明显的影响。2.4　分批培养条件下球形红假单胞菌群体生长

球形红假单胞菌在生物反应器内培养,其群体生长自接种后经过3个主要时期:延迟期、指数生长期和稳定期,遵循生物群体有限增长定律,即Logistic方程,如图1所示。延迟期为2d,初始浓度为0.93OD值,经2d培养达1.0OD值,随后生长速度增快,第4d达1.16OD值,第6d达1.5OD值,第9d达1.95OD值,这一阶段为指数生长期,生长最快,以后生长缓慢进入稳定期。　　表6表明,酵母浸膏的最适添加量为2.4

g/L,烟酸的最适添加量为6mg/L。2.3　培养条件的选择2.3.1　温度对红螺菌发酵的影响　本试验选择25,28,30,34,36℃的条件下培养红螺菌,结果是25～36℃的范围内皆可生长,30～34℃生长最快,超过42℃,低于4℃则菌体下沉。2.3.2　光照强度对红螺菌发酵的影响　红螺菌在厌氧条件下,利用光能氧化有机物,获得能量,以供生长繁殖所需,红螺菌进行光合作用所吸收3期　　　　　　　　　　　　　　　　　　许进香等:光合细菌规模生产工艺研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　29

2.5　菌液浓缩及分离技术对光合细菌应用前景的影响

日本市场出售的光合细菌浓度达50亿个菌体/ml,据试验结果,静置培养细菌浓度仅达5×

108/ml,流动培养细菌浓度达3×109/ml,为了提高细菌的浓度,菌液浓缩是必要的,浓缩后的细菌浓度超过50亿/ml,可久放而不被霉菌污染,应用时添加量少,每吨饲料需添加3000ml,便于操作和运输。应用絮凝剂使光合细菌沉淀是完全可以实行的,比用离心机实行菌液分离,具有简便、价

图1　球形红假单胞菌在玻璃生物反应器内

　　　　生长曲线图

[1]　徐浩等.培养光合微生物的方法.工业微生物学基础及其应

用,1991,179.[2]　Shipman,R.H.,Fan,L.T.,Kao,I.C.:Siryle-cellprocein

producitionbyphotosyntheticbacteria,Adv,Appl.Microbiol.1977,21,161～183.[3]　徐浩等.培养光合微生物的方法.工业微生物学基础及其应

用,1991,178.[4]　王应铨,许福康.光合细菌培养技术探讨.应用微生物,

1985,113(5):9～10.

廉等优点,特别适合于工业化规模生产,对光合细

菌菌体蛋白的开发应用具有推动作用。

[5]　张克强,陈秀为.光合细菌规模生产技术的研究.农业环境

与发展,1994,42(4):31～33.[6]　徐浩等.培养光合微生物的方法.工业微生物学基础及其应

用,1991,180.

[7]　朱章玉,俞吉安等.利用光合细菌净化有机污水.光合细菌

的研究及其应用,1991,242～258.[8]　朱核光,史家林,徐亚同.光合细菌法处理酒槽废水的试验

研究.上海环境科学,1995.

参　考　文　献

CULTUREOFPHOTOSYNTHETICBACTERIAONALARGESCALE

XuJinxiangetal.

(Univ.Agric.&Anim.Sci.PLA,Changchun)

Abstract　ADesignandmanufactureofglassbioreactorforculturingphotosyntheticbacteria(PSB)onalargescaleisre-ported.Thetemperatureandflowingcultureadoptedautomaticcontrol.Experimentofaddingamountofcarbon,nitrogen,

mineralelementsandothergrowthfactorsweredone.Amongthemyeastextracthasthebestgrowingeffect.Glucose,citricacid,malicacid,malicacid,mannitol,nicotinicacidandtartaricacidweregood.Ammoniumchloridewasthebestnitrogensource,ammoniumsulfatethesecond.Theoptimumaddingamountofsodiumacetate,ammoniumchloride,manganesesul-fate,ferroussulfate,cobaltchloride,yeastextractandnicotinicacidwere1.75g/L,0.75g/L,25μg/L,25mg/L,2.75mg/L,2.5g/Land6mg/Lrespectively.Theoptimumilluminationintensity,temperatureandpHwere5000LX,30～34℃and7.0～7.5respectively.AflocculatingagentmakesthePSBprecipitationnaturally,andthissimplifiestheprocessing.Thecellden-sitywas1.5g/Lintheexperiment,whilereportfromabroadwas1.3g/L.

Keywords　photosyntheticbacteria(PSB)technology,bioreactor,celldensity,flocculatingagent.

　　(上接19页)

POLYMORPHISMOFWILDXIANGGUMUSHROOM

(LENTINUSEDODES)MITOCHONDRIALDNA

ZhouWenlietal.

(BiologicalProductPharmaceuticalInst.Ji'nanMilitaryRegion,Zhumadian463000)

Abstract　TwodomainsofmitochondrialDNAfrom20strainsofwildXiangguMushroom(Lentinusedodes)collected

fromsevenprovinceswereamplifiedbyPCRtechnique.PolymorphismofthetwodomainsofDNAwasstudiedusingrestrictedenzymes.TheresultsindicatedthatmitochondrialDNAofinter-strainsofthe20wildstrainscouldbedividedintotwoclasses.Thesimilarityis70%.Ascomparedwithcultivatedones,therearebiggeneticdifferences.

Keywords　Xianggumushroom(Lentinusedodes),mitochondrialDNA,RFLPs.