ALA测定方法

1.2.1 番茄叶片内源ALA含量、ALA合成和代谢能力的测定

1.2.1.1 内源ALA含量测定

参照Harel和Klein(1972)法进行。取0.1 g幼嫩叶片，用200 mmol?L-1乙酸缓冲液(pH 4.6)研磨，经离心(5000 g × 15 min)后，取上清液，立即加入乙酰丙酮原液，在100 ℃条件下缩合10 min，冷却至室温后，加入1 mL新鲜Ehrlish’s试剂(成分为42 mL冰乙酸+8 mL 70%高氯酸，加入1 g二甲氨基苯甲醛)显色，摇匀后静置5-10 min，测定553 nm处OD值。

1.2.1.2 ALA合成能力、代谢能力测定

将一定量的离体番茄叶片放置于盛有20 mmol?L-1乙酰丙酸(LA，一种ALA代谢抑制剂)溶液的培养皿中，在40 μmol?m-2?s-1光照下诱导6 h，在阻断ALA代谢情况下测定ALA含量，作为ALA合成能力。经LA诱导测定的ALA含量与直接测定的内源ALA含量的差值，即为ALA代谢能力(Harel和Klein, 1972)。

1.2.2 ALA合酶(ALAS)和ALA脱水酶(ALAD)活性测定

1.2.2.1 ALAS活性测定

取0.1 g番茄幼嫩叶片，加入1.5 mL 20 mmol?L-1磷酸缓冲液(pH 7.6)，研磨匀浆。10000 × g，4℃，离心10 min，上清即为酶液。ALAS活性测定按Hampp(1975)法进行。取0.3 mL酶液加入到反应混合液(含50 mmol?L-1 Tris-HCl，pH 7.5, 10 mmol?L-1 MgCl2，100 mmol?L-1甘氨酸，270 μmol?L-1磷酸吡哆醛，8.45 mmol?L-1 ATP，100 mmol?L-1

琥珀酸钠，370 μmol?L-1 CoA 和100 mmol?L-1 乙酰丙酸)中，37℃反应30 min，加入100 g?L-1的TCA液终止反应，4000×g，离心 5 min。取300 μL上清液加到盛有400 μL 1 mol?L-1乙酸钠溶液的试管中，加入50μL乙酰丙酮，100℃水浴15min。冷却后，加入等体积新鲜Ehrlish’s试剂，5 min后553 nm比色，分析ALA合成量。ALAS活性以每小时内每毫克蛋白催化生成ALA的量表示。叶片蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定(李合生, 2000)。

1.2.2.2 ALAD活性测定

取0.1g番茄幼叶，加入1.5 mL 50 mmol?L-1 Tris-HCl缓冲液(pH8.5，内含8 mmol?L-1 MgCl2和5 mmol?L-1巯基乙醇)，匀浆后，10000×g，4℃，离心10 min，上清即为酶液。参照Mauzerall(1956)方法并加以改进。将0.2 mL酶液在37℃活化30 min，加入0.3 ml 50 mmol?L-1 ALA，37℃反应30 min后，加入0.5 mL 100g?L -1 TCA液终止反应。将上清液取出，加入0.5 mL的Ehrlish’s试剂，555 nm比色，计算胆色素原(PBG)的含量，其吸光系数是6.1×104 M-1?cm-1，以每毫克蛋白每小时催化产生的PBG量表示ALAD酶活性。