电转化细胞制作及电转步骤

质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤

实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于 DNA 等大分子进入。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109 ～ 1010 转化子/μg DNA。，

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2．取 2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；

3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入 1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟

8．弃去上清，加入 750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．4℃下3000g冷冻离心5分钟

10．加入 20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

11．立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。

·质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤

1．制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中加入 250μl Amp （100mg/ml）, 250μl X-gal (20mg/ml), 25μl IPTG (200mg/ml), 混匀后倒入灭

菌培养皿中；

2．取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3．每管感受态细胞加入 1μl 连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；

4．电转化仪选择 1800V 作为输出电压；

5．将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化杯中，立即按下按纽电击；

6．立即加 1ml SOC 培养基到转化杯中重悬细胞；

7．将细胞转入合适的培养管中37℃培养 1 小时；

8．吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；

9．37℃培养过夜，观察结果。

附注：

1．利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（ 90mm 平板上不得超过 105个菌落），同时 37 ℃ 培养不应超过 20 小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。

2．鉴定转化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有：

①α互补；②杂交筛选；③插入失活（一些老质粒如 pBR322 等）;

④小量提取质粒，并酶切或 PCR 检测。

3．SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。