高效液相色谱法同时测定黄芪中的五种异黄酮类成分

色谱Vol.24No.5

ChineseJournalofChromatography

486～488

高效液相色谱法同时测定黄芪中的五种异黄酮类成分

王晓辉,　刘　涛,　李　清,　陈晓辉,　毕开顺

(沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110016)

摘要:对蒙古黄芪中5种异黄酮类成分的含量进行了反相高效液相色谱法测定。色谱柱为DiamonsilC18柱,流动

β2相为乙腈2水系统,梯度洗脱,检测波长230nm,柱温35℃。毛蕊异黄酮272O2葡萄糖苷在20112～20112mg/L、D2

β2β2芒丙花素272O2D2葡萄糖苷在4162～4612mg/L、9,102二甲氧基紫檀烷232O2D2葡萄糖苷在4186～4816mg/L、毛蕊异黄酮在9124～9214mg/L、芒丙花素在6192～6912mg/L时峰面积与浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为

019992,019997,019997,019995和019995。5种成分的加样回收率均高于94%,相对标准偏差(RSD)小于312%(n=9)。该法简便快速,重复性良好,结果准确可靠,可用于黄芪药材中5种主要异黄酮类成分的含量测定。关键词:反相高效液相色谱法;异黄酮;黄芪中图分类号:O658　　文献标识码:A　　文章编号:100028713(2005)0520486203　　文章栏目:研究论文SimultaneousDeterminationofFiveIsoflavonoidsinCommercialRadixAstragalibyHighPerformanceLiquidChromatography

WANGXiaohui,LIUTao,LIQing,CHENXiaohui,BIKaishun

(SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China)

Abstract:Areversed2phasehighperformanceliquidchromatographicmethod(RP2HPLC)wasdevelopedforthesimultaneousanalysisoffiveisoflavonoidsofHuangqi,therootsofAstraga2lusmongholicus.HPLCdeterminationwasperformedonaDiamonsilC18column(200mm×

416mmi.d.,5μm)anddetectedat230nm.Themobilephaseconsistedof(A)acetonitrile

and(B)water.Gradientprogramwasadoptedasfollows:0-25minfrom17%Ato31%A,25

-45min35%A.Theflowratewasmaintainedat110mL/min.Themethodwasprovedtobe

linearintherangesof20112-20112mg/L(r=019992),4162-4612mg/L(r=019997),4186

-4816mg/L(r=019997),9124-9214mg/L(r=019995)and6192-6912mg/L(r=

β2β2D2D2019995)forthefiveisoflavonoids,calycosin272O2glucoside,formononetin272O2gluco2β2D2side,9,102dimethoxypterocarpan232O2glucoside,calycosinandformononetin,respectively.

Therecoveriesweregreaterthan94%,andrelativestandarddeviationswerelessthan312%.Themethodhasbeensuccessfullyappliedtothesimultaneousdeterminationofthefiveisofla2vonoidsofradixastragali.

Keywords:reversed2phasehighperformanceliquidchromatography(RP2HPLC);isoflavonoid;

radixastragali

　　黄芪为多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus

membranaceusmongnolicus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astraga2lusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。其

β2O2D2葡萄糖苷和芒丙花素的含量,未见有关黄芪β2中芒丙花素272O2D2葡萄糖苷和9,102二甲氧基紫

β2D2檀烷232O2葡萄糖苷含量测定的报道。国外有用液相色谱2质谱法(LC2MS)法测定异黄酮类成分的[5-6]

报道。鉴于液相色谱2质谱联用仪在国内还未被普遍使用,因此建立简便快捷的高效液相色谱法测定黄芪中异黄酮类成分的含量具有一定的理论和实用意义。本文建立了黄芪中5种主要异黄酮含量的测定方法。

味甘,性温,归肺、脾经,具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效。黄酮类成分为其有效成分之一,有抗病毒、抗菌、降血脂、抗氧自由基等作用,还具有抗缺血和改善血象作用。近年对异黄酮类成分

[1-4]

含量测定方面的报道多为测定毛蕊异黄酮272

收稿日期:2005210227

第一作者:王晓辉,女,硕士研究生,Tel:(024)81200338,E2mail:xiaohui_02000@yahoo.com.cn.通讯联系人:毕开顺,男,教授,博士生导师,Tel:(024)23986016.

　第5期王晓辉,等:高效液相色谱法同时测定黄芪中的五种异黄酮类成分

・487・

1　实验部分

1.1　仪器和药品

　　日本岛津LC22010A高效液相色谱仪;RE252A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HHS112型恒温水浴箱(江苏省医疗器械厂);石英亚沸高纯水蒸馏器(天津市金洲科学仪器有限公司);甲醇为分析纯,乙腈为色谱纯;黄芪药材经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为正品药材;5种异黄酮对照品均从蒙古黄芪根中提取分离得到,并经光谱鉴定和色谱法分析,纯度在99%以上。1.2　对照品溶液的制备　　分别精密称取5种异黄酮化合物对照品适量,置于50mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配制成β2β2D2含毛蕊异黄酮272O2葡萄糖苷(calycosin272O2

β2D2glucoside)20112mg/L,芒丙花素272O2D2葡萄糖

β2苷(formononetin272O2D2glucoside)4612mg/L,

β29,102二甲氧基紫檀烷232O2D2葡萄糖苷(9,102dim2β2D2ethoxypterocarpan232O2glucoside)4816mg/L,毛蕊异黄酮(calycosin)9214mg/L和芒丙花素(for2

mononetin)6912mg/L的标准储备液。1.3　供试品溶液的制备　　取黄芪药材粉末约2g,精密称定,加入20mL的80%甲醇回流1h,重复提取3次,合并提取液,于80℃下减压浓缩至干,以甲醇溶解并定容至10mL。经0145μm微孔滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液。1.4　色谱条件与系统适用性试验　　色谱柱:DiamonsilC18柱(200mm×416mmi.d.,5μm),迪马公司。流动相:A,乙腈;B,水;梯度洗脱程序:0～25min,17%A～31%A;25～45min,35%A。流速:110mL/min;检测波长:230nm;柱温:35℃;进样量:10μL。

　　在上述色谱条件下,取同一混合对照品溶液10μL连续进样5次,记录色谱图,结果见图12a。5种异黄酮成分的峰形良好,分离度大于115,理论塔板数均不低于7000。

图1　(a)5种异黄酮对照品和(b)实际黄芪样品的色谱图Fig.1　Chromatogramsof(a)amixtureoffiveflavanoid

referencesand(b)arealradixastragalisample

β2β2D2glucoside;2.formononetin2D21.calycosin272O272O2

β2D2glucoside;3.9,102dimethoxypterocarpan232O2glucoside;

4.calycosin;5.formononetin.

5

β211481×10(r=019992);芒丙花素272O2D2葡萄

糖苷,y=21756×10x+31049×10(r=019997);

β2D29,102二甲氧基紫檀烷232O2葡萄糖苷,y=11958×10x+11315×10(r=019997);毛蕊异黄酮,y

74

=41739×10x+31075×10(r=019995);芒丙花

74

素,y=41394×10x+21239×10(r=019995)。

β2结果表明:毛蕊异黄酮272O2D2葡萄糖苷在20112β2D2～20112mg/L、芒丙花素272O2葡萄糖苷在4162

β2D2～4612mg/L、9,102二甲氧基紫檀烷232O2葡萄糖苷在4186～4816mg/L、毛蕊异黄酮在9124～

9214mg/L、芒丙花素在6192～6912mg/L时峰面积与浓度呈良好的线性关系。2.2　精密度试验

7

4

74

　　仪器精密度:取对照品溶液,连续进样6次,在上述色谱条件下测定,测得峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为019%,116%,117%,119%和214%。表明仪器的精密度良好。

　　方法精密度:取黄芪药材粉末6份,按“1.3”节所述方法制备样品溶液,在“1.4”节色谱条件下测

β2定,分别进样10μL,测得毛蕊异黄酮272O2D2葡萄

β2糖苷、芒丙花素272O2D2葡萄糖苷、9,102二甲氧基

β2紫檀烷232O2D2葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒丙花素含量的RSD分别为311%,314%,219%,310%和

315%。表明该方法的重复性良好。2.3　稳定性试验　　取黄芪药材粉末,按“1.3”节所述方法制备样品溶液,分别于0,2,4,8,12和24h测定,测得5种异黄酮峰面积的RSD分别为213%,019%,116%,218%和016%。表明供试品溶液在24h内稳定。2.4　回收率试验　　采用加样回收法,选取含量已知的黄芪样品,按

2　结果与讨论

2.1　标准曲线的建立

　　分别精密吸取对照品储备液110,210,410,

610,810和1010mL至10mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,进样10μL。分别以各成分的质量浓度(x,mg/L)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,建立标准曲线。得到5个待分析物的标准曲线如下:毛

7

β2D2蕊异黄酮272O2葡萄糖苷,y=21769×10x+

・488・色谱

2.6　色谱条件的优化

第24卷

高、中、低浓度分别精密加入对照品溶液610mL,

410mL和210mL,按“1.3”节所述方法制备样品溶液,制成高、中、低3个浓度的供试品溶液,在上述色谱条件下,进样10μL。每个浓度重复试验3次,计算平均回收率。结果见表1。

表1　样品中5种成分的回收率(n=3)

Table1　Recoveriesoffivecomponentsinsample(n=3)

Component

Added/

Found/

Recovery/

%

RSD/%

β2　　毛蕊异黄酮272O2D2葡萄糖苷和毛蕊异黄酮的

峰值吸收波长均为219nm,250nm和290nm;芒

β2D2丙花素272O2葡萄糖苷和芒丙花素的峰值吸收波长均为251nm和300nm;9,102二甲氧基紫檀烷232

β2O2D2葡萄糖苷的峰值吸收波长为207nm,232nm和280nm,但低波长处的吸光系数远大于高波长处的吸光系数。本文用LC210ATvp高效液相色谱仪、SPD2M10Avp二极管阵列检测器对检测波长进行了选择,在230nm处,5个待测成分的吸收强度较大且杂质不干扰测定,故选择230nm为检测波长。在230nm处,各成分的吸光系数较大,检测限均不低于0105mg/L。2.7　样品预处理方法的优化μg

40124

80148120179124181482717291721914429116181483619655144131842716841152

μg

3911879191116109116181382618591551913728154181293516854192131032713339176

β2Calycosin272O2

　D2glucoside

Formononetin272O2

9714

99139611991199159619981399169719981996159911941298179518

211312113215210112113213114119216119110211119

β2D2　glucoside

9,102Dimeth2

　oxypter2ocarpan2

β2D2glucoside　32O2

Calycosin

Formononetin

　　在预试验中,作者考察了超声提取、冷浸提取、

回流提取和索氏提取等不同的提取方法。结果表明,回流提取和索氏提取的效率明显高于超声提取和冷浸提取,而回流提取和索氏提取的效率无明显差异,故本文采用回流法提取。

　　考察了不同的提取溶剂(100%乙醇,80%乙醇,60%乙醇,100%甲醇,80%甲醇,60%甲醇,水和水提后分别以95%,80%,60%乙醇醇沉)对提取效率的影响,结果表明80%甲醇的提取效率最高。

2.5　样品含量测定

　　取不同产地的黄芪药材,按“1.3”节所述方法制备样品溶液。精密吸取供试品溶液10μL,进样分析,按外标一点法计算,结果见表2。

表2　不同产地黄芪样品中异黄酮类成分的含量(n=3)Table2　Contentofisoflavonoidsindifferentradix

μg/gastragalisamples(n=3)

Source

Harbin,HeilongjiangSiping,Jilin

Qinhuangdao,HebeiChengde,HebeiKaiyuan,LiaoningChangchun,JilinAnshan,LiaoningHuludao,LiaoningDalian,LiaoningNeiMongol

Components3

3　结论

　　本文采用高效液相色谱法同时测定了黄芪中的

5种异黄酮类成分,该法灵敏度高,专属性强,所用流动相系统和样品预处理方法简单,快速,能准确有效地测定黄芪中5种主要异黄酮的含量。参考文献:

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14391823911274163501320312340162481128213

25014058163781677211764194981055913480165

321815125111001616019

415012224132541919210

5891711018831315317781597014112911157101761415916

4611913911

371962481655140128186611229016421422981113413

39412

3910325316

5131311419

β2β2D2D2　　1.calycosin272O2glucoside;2.formononetin272O2

β2D2glucoside;3.9,102dimethoxypterocarpan232O2glucoside;

4.calycosin;5.formononetin.

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ZhangChao.

ActaChinese

MedicineandPharmacology(马英丽,赵怀清,王学娅,田

　　不同产地的黄芪药材中均含有这5种异黄酮类

β2成分,且含量均较高。其中毛蕊异黄酮272O2D2葡萄糖苷的含量最高。在各产地药材中这5种成分的

含量差异比较显著。但由于收集到的样本数较少,且所收集的药材均来自北方,目前尚不能全面地比较不同产地药材中各成分的差异。

振坤,周迎春,鲁鑫炎,张超.中医药学报),2003,31(2):

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