去除逆转录和扩增反应中的核酸污染的方法[发明专利]

*CN102510904A*

(10)申请公布号 CN 102510904 A(43)申请公布日 2012.06.20

(12)发明专利申请

(21)申请号 201080033460.4(22)申请日 2010.07.21(30)优先权数据

0912637.6 2009.07.21 GB61/235,177 2009.08.19 US(85)PCT申请进入国家阶段日 2012.01.20

(86)PCT申请的申请数据

PCT/GB2010/001384 2010.07.21(87)PCT申请的公布数据

WO2011/010094 EN 2011.01.27(71)申请人生物科技医药公司

地址挪威特罗姆瑟

(72)发明人莫顿·艾尔得 欧拉乌·莱尼斯

达格·如尼·耶莱斯维克(74)专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理

有限责任公司 11204()发明名称

去除逆转录和扩增反应中的核酸污染的方法(57)摘要

本发明提供了从逆转录反应和热启动PCR去除核酸污染的方法，其中所述热启动PCR是隔离热启动PCR装置和/或涉及热启动DNA聚合酶，所述方法包括使用这样的DNase，该DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。本发明还提供了DNase、编码所述DNase的核酸和包含所述DNase或所述核酸的试剂盒或组合物，所述DNase在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

代理人王达佐 洪欣(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12N 9/22(2006.01)

权利要求书 2 页 说明书 22 页权利要求书2页 说明书22页序列表 19 页 附图 18 页序列表19页 附图18页

CN 102510904 ACN 102510904 A

权 利 要 求 书

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1.从逆转录反应去除核酸污染的方法，其包括使用这样的DNase，该DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

2.从热启动PCR去除核酸污染的方法，其中所述反应是隔离热启动PCR装置和/或涉及热启动DNA聚合酶，所述方法包括使用这样的DNase，该DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将逆转录反应混合物、热启动PCR装置、热启动PCR混合物或以上的任一种单独的组分在允许消化任何污染的双链DNA的条件下与DNase接触，以及此后将所述反应混合物加热以使所述DNase失活。

4.体外逆转录靶核酸的方法，其中所述方法包括在真正的逆转录反应开始之前，用DNase处理逆转录反应混合物的步骤，所述DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述逆转录反应混合物是完整的混合物，并且在逆转录酶的工作温度加热以使所述DNase失活。

6.如权利要求4或5所述的方法，所述方法包括一个或多个包含以下步骤中的一步或多步的循环：

(i)引物退火

(ii)从引发的多核苷酸的链延伸(iii)多核苷酸双螺旋解链。

7.如权利要求1和3至6中任一项所述的方法，其中所述逆转录反应之后为核酸扩增反应。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸扩增反应是PCR、LCR、SDA、3SR或LAMP，优选PCR。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述逆转录反应和所述扩增反应在一个反应容器中进行。

10.热启动PCR的方法，其中所述反应是隔离热启动PCR装置和/或涉及热启动DNA聚合酶，其中所述方法包括在热启动PCR开始之前，用DNase处理热启动PCR装置/混合物或热启动DNA聚合酶的步骤，所述DNase通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，所述方法还包括多个包含以下步骤中的一步或多步的循环：

(i)多核苷酸双螺旋解链(ii)引物退火

(iii)从引发的多核苷酸的链延伸。12.DNase，其通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

13.DNase或其酶活性片段，所述DNase具有SEQ ID No.1的序列或具有与SEQ ID No.1至少60％同一性的序列，但是其中SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸残基或其它序列中的等同脯氨酸已被修饰、缺失或取代，所述DNase或其酶活性片段通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

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权 利 要 求 书

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14.如权利要求13所述的DNase或其酶活性片段，其中所述DNase具有SEQ ID No.5的序列或具有与SEQ ID No.5至少60％同一性的序列，但是其中SEQ ID No 5的第214位的脯氨酸残基或其它序列中的等同脯氨酸已被修饰、缺失或取代，所述DNase或其酶活性片段通过在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

15.如权利要求13或14所述的DNase或其酶活性片段，其中所述DNase具有获自来自节肢动物门的物种的DNase的序列，但是其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。

16.如权利要求15所述的DNase或其酶活性片段，其中所述DNase具有获自选自以下亚门的物种的DNase的序列：甲壳亚门、六足亚门、螯肢亚门或多足亚门，但是其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。

17.如权利要求15或16所述的DNase或其酶活性片段，所述DNase具有获自选自以下物种的DNase的序列：北极甜虾、堪察加拟石蟹(帝王蟹)、日本囊对虾(斑节虾)或日本对虾，但是其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。

18.如权利要求17所述的DNase或其酶活性片段，所述DNase具有获自北极甜虾的DNase的序列，但是其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。

19.如权利要求12至18中任一项所述的DNase，所述DNase具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7的序列。

20.编码权利要求12至19中任一项所述DNase的核酸分子。21.如权利要求20所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

22.权利要求12至19中任一项所述DNase在核酸扩增方法中作为去污染剂的用途。23.权利要求12至19中任一项所述DNase在权利要求1至11中任一项所述方法中的用途。

24.用于分离和纯化权利要求12至19中任一项所述DNase或其片段的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达所述DNase或其片段，以及随后从所述宿主细胞和/或培养所述细胞的培养基中分离所述DNase。

25.用于实施权利要求1至11中任一项所述方法的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包含权利要求12至19中任一项所述DNase和/或权利要求20或21所述核酸；以及任选以下的一种或多种：

(i)核苷三磷酸；(ii)寡核苷酸引物；(iii)逆转录酶；(iv)DNA聚合酶；(v)DNA连接酶；和(vi)性酶。

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说 明 书

去除逆转录和扩增反应中的核酸污染的方法

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发明领域

本发明涉及通过使用DNase从逆转录反应混合物、热启动DNA聚合酶制剂和热启

动PCR反应混合物中去除污染DNA。本发明还涉及通过使用DNase来防止核酸扩增反应，尤其是涉及靶序列的逆转录、热启动DNA聚合酶和/或隔离热启动PCR装置的扩增反应中的假阳性结果。本发明还涉及适用于这些方法的极不耐热的DNase。[0002] 发明背景

[0003] 核酸扩增技术如聚合酶链式反应(PCR)是可用于生物技术领域中的最有力的工具之一，其允许由仅含有少量核酸的样品制备出大量拷贝的靶序列。就PCR而言，将与双链靶序列的各链互补的寡核苷酸引物添加到含有靶序列和游离核苷酸的反应混合物中。在DNA聚合酶存在下的热循环导致引物间序列的扩增。由PCR过程所产生的扩增片段能用作随后PCR循环的模板的能力导致快速产生大量的靶序列。即使一个拷贝的靶序列也能够产生足以允许通过例如与标记探针杂交或将32P标记的脱氧核苷三磷酸掺入扩增节段检测的核酸

[0004] 连接酶扩增反应(LAR)也称为连接酶链式反应(LCR)，与PCR类似，其利用重复循环和交替温度来实现靶序列拷贝数的指数增加。在这种方法中，DNA连接酶催化与靶DNA链中的一条的邻近区互补的两段寡核苷酸的连接。与另一条链互补的另两段寡核苷酸也可以被连接。变性之后，最初的模板链和两段连接对可以用作下一轮杂交和连接的模板。

[0005] 链置换扩增(SDA)利用参与DNA切除DNA修复的酶的特性来用新合成的链替换DNA双螺旋中的一条带缺口的DNA链。为了重复产生带缺口的单链，使用诸如HindI或BsoBI的性内切核酸酶，当DNA的互补链被半硫代磷酸化时，这些性内切核酸酶仅在其识别位点的一条链上使DNA产生缺口。本方法中所用的引物含有合适的识别位点，并且在聚合反应中使用dATPαS。

[0006] 基于核酸序列的扩增(NASBA)也称为3SR(自主序列复制)，本质上是天然逆转录病毒转录的体外形式。3SR涉及由RNA模板重复逆转录以形成cDNA模板。RNA聚合酶从cDNA模板产生相应的RNA。

[0007] 环介导的等温扩增(LAMP；Notomi，T.等，Nuc.Acid Res.2000 VoI 28(12)e63)是基于自动循环的链置换DNA合成的原则。具有高的链置换活性的DNA聚合酶(例如，Bst DNA聚合酶大片段)与特异设计的引物一起使用。该过程在不需要解链的情况下通过链分离来展现新的靶序列(因而该过程是等温的)。[0008] 逆转录是这样的过程，在该过程中，单链RNA(ssRNA)模板被转录成互补的单链DNA，然后，单链DNA可用来形成双链DNA(dsDNA)。一些酶能够产生第一DNA链且能够合成第二链以形成dsDNA，而其它酶仅对两个步骤中的一个是特异的。然后，ssDNA和dsDNA可用于多种分子生物学应用中。例如，它们能直接用于基于探针的检测测定(例如Southern印迹)、测序实验或克隆方案中。通常，cDNA在诸如PCR、LCR、SDA、LAMP或3SR的扩增反应中可被进一步扩增，从而例如为上述实验提供更多的物质或者能够定量初始样品中所存在的RNA模板的量。

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说 明 书

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逆转录连接的扩增反应可以是“一步”法或“两步”法。在一步法中，逆转录反应

和核酸扩增反应中的组分存在于一个反应容器中，并且通常选择早期反应条件以允许进行逆转录反应至完成，然后将反应条件转换成适于允许进行核酸扩增反应的条件。[0010] 在两步法中，首先将逆转录反应的组分混合，并进行逆转录反应。然后将逆转录产物与扩增反应的组分混合，并进行扩增反应。在“一管”两步方案中，将扩增反应组分添加至进行逆转录反应的同一反应容器中。在“两管”两步方案中，在新的反应容器中进行扩增反应。

[0011] 在一步法或两步法中，逆转录可以与PCA、LAMP、LCR、SDA或BSR中的任一种联合。就SDA而言，应选择热稳定的链置换酶和热稳定的性酶(例如BsoB1)。

[0012] 这些扩增技术扩增微量靶序列的能力使得它们对RNA靶序列(即按照或利用逆转录的那些扩增反应)情况下通过基因组DNA的污染和通过DNA分子中的靶序列来自之前的扩增反应的污染高度敏感，以上两种污染均可能残留在试剂(例如聚合酶、引物、反应缓冲液等)、移液装置、实验室表面、手套或气雾化中。通过搅动溶液如溢出过程中，或者甚至是通过搅动容器表面的少量的物质如塑料管盖的内表面上的残留物都能够产生气溶胶，当打开所述塑料管时残留物能够雾化。当为了医疗诊断或法医原因来研究样品核酸时，由通过偶然引入到可能包含靶序列的核酸(称为残留物)的反应混合物所导致的假阳性结果的影响可能是深远的。

[0013] 对核酸污染具有不利影响的特定灵敏度的扩增反应是定量PCR技术，因为这些技术有能力对反应中不到20拷贝的DNA序列进行定量。因此，即便是最低水平的核酸污染也可能在qPCR技术中产生假结果。此外，这些方法需要检测来自不可避免的背景信号之上的扩增靶核酸的信号。污染的核酸能提高该背景信号，并因此降低该技术的灵敏度。因此，将污染的核酸降至最低能使定量PCR实验的灵敏度最大化。在检测少量拷贝数的靶核酸的实验中，例如基于定量PCR的病原体诊断和病原体负荷定量实验，最重要的是使定量PCR的灵敏度最大化和假阳性最小化。在细菌鉴定和诊断领域，其中通过qPCR技术靶向于高度保守的细菌DNA节段(例如16SrRNA或23SrRNA基因)，来自DNA聚合酶制剂的核酸污染(通常获自细菌或细菌表达系统)是主要问题。因此需要从DNA聚合酶制剂有效去除细菌核酸污染物的方法。尤其寻求能实现这点，并且对下游扩增反应没有不利影响和不损坏聚合酶的方法。

[0014] 已经开发出多种用于防止或残留物影响的技术。就PCR而言，这些技术包括巢式引物，即与用来起始PCR的两种引物的退火边界内的靶序列退火的引物(K.B.Mullis等，Cold Spring Harbour Symposia Vol.L1，pp 263-273，1986)。巢式引物的较短的PCR扩增产物不能与起始引物退火，所以如果是该产物被残留，那么使用起始引物就不会扩增该残留物。然而，并没有去除残留物，如果在随后的PCR中使用相同的巢式引物，则巢式引物之前扩增的产物会被扩增。

[0015] 已开发出的方法涉及将核苷酸脱氧尿苷三磷酸(dUTP)替代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)掺入逆转录的/扩增的核酸序列中。由于脱氧尿苷(dU)通常并非存在于天然存在的DNA中，因此该碱基能将之前产生的扩增子与新的靶序列区分开来。在另一逆转录/扩增反应开始之前，可以用尿嘧啶DNA转葡糖基酶(UNG)处理扩增反应混合物，该酶去除尿嘧啶碱基，保持糖-磷酸二酯骨架完整，并在单链(ss)和双链(ds)DNA中产生了脱碱基位点

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说 明 书

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(US-A-5,418,149)。提高扩增反应混合物的温度，以便在脱碱基位点处切割DNA，这会导致残留物的降解。

[0016] 该方法同样并非没有问题，因为将dUTP掺入逆转录/扩增产物能干扰随后的产物分析，例如通过性酶切割或PCR(聚合效率可被降低，并且排除了校正聚合酶的使用)。同样，UNG应被不可逆地失活，否则来自随后逆转录/PCR反应的产物会被降解。提高温度是使UNG酶失活的常用方法，但是迄今很多商购的UNG酶即便在暴露于PCR反应的温度之后也不会被成功失活。为了使残余UNG活性的影响最小化，扩增反应中所用的温度步骤必须高于℃，并且反应容器必须保持高温或马上冷冻，以防止同样含有尿嘧啶的新产生的扩增被降解。最近，描述了来自鳕鱼的UNG，当在50℃孵育10分钟时，其能够完全不可逆地失活，并且这使得基于UNG的方法获得更广泛的应用。[0017] 然而，进一步任何UNG系统的是它无法去掉反应混合物中的污染基因组DNA，因为基因组DNA没有尿嘧啶修饰。因此，UNG系统不能解决逆转录反应的基因组DNA污染的问题。

[0018] 还推荐在添加靶DNA和Taq DNA聚合酶之前用DNaseI或性核酸内切酶处理单独的PCR反应混合物，所述DNaseI或性核酸内切酶切割靶序列的内部，因此防止污染的DNA扩增(Furrer等，Nature.Vol.346 page 324，1990)。同样，可以在添加逆转录酶之前，以这种方式处理逆转录反应混合物。该方法需要30分钟的去污染时间，并且为了在去污染之后使DNaseI或性核酸内切酶失活，将反应混合物煮沸。由于该煮沸步骤，必需在去污染之后添加DNA聚合酶或逆转录酶。当然，这表示还存在将残留物引入扩增前/逆转录前混合物中的风险，并且排除了DNA聚合酶本身的去污染。由于DNaseI对单链DNA的活性，在本方法中必须使用1μM的引物浓度。

[0019] 还描述了更不耐热的DNase。WO99/007887公开了分离自北极甜虾的DNase，该DNase在94℃持续2分钟后会基本不可逆地失活。该酶在65℃持续15分钟后也会基本不可逆地失活。Anisimova等(Biotechnology Letters；2009，31：251 to 257)描述了帝王蟹(堪察加半岛蟹、堪察加拟石蟹)DNase的随机突变形式，其在65℃孵育10分钟后失活，但是如果使用失活添加剂DTT(1-4二硫苏糖醇)和EDTA，可以在低至55℃持续10分钟后实现失活。

[0020] EDTA是金属离子螯合剂，所以能够干扰对金属离子浓度敏感的酶的作用。Anisimova指出，帝王蟹DNase的活性受到Mg2+离子的正向影响，所以EDTA通过隔离该激活剂对该酶的失活起作用。DNA聚合酶还对金属离子浓度非常敏感，尤其是一定要小心控制聚合酶反应混合物中的Mg2+含量。因此，在DNase失活步骤中使用EDTA有可能直接抑制下游聚合酶反应的活性。因此，不适于在聚合酶反应(例如逆转录、PCR、SDA、3SR)之前的处理步骤中使用EDTA。

[0021] 由于Anisimova所提供的突变的帝王蟹DNase需要在EDTA的存在下使得在低于65℃的温度下发生失活，该DNase不适用于逆转录反应(其通常在约50℃进行)之前的DNA污染物去除步骤。为了允许使用该酶而不会发生EDTA抑制下游步骤的风险，必须具有将混合物加热至65℃以上的失活步骤。由于这高于典型的逆转录反应温度，该步骤将是单独的，并且还要有逆转录步骤。这为该过程增加了其它的步骤，从而增加该过程的复杂度和劳动强度，在这一过程可能被多次重复的分子生物学领域中，其还在能源成本和设备使用

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时间方面表现出明显的不利。此外，如果逆转录酶不是在DNase处理和失活之后添加，那么DNase在逆转录步骤过程中是有活性的，因此存在cDNA产物会被降解的风险。随后向反应混合物添加逆转录酶将表示有发生污染的机会，难于将该过程作为一个整体，并且再次牵涉到成本问题。

发明内容

[0022] 本发明人已经认识到，处于与逆转录步骤兼容的温度时会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的DNase将提供高效且有效的方法。然而，目前还无法获得具有这些特性的DNase。这样的DNase能够在逆转录反应之前用于使完全逆转录反应混合物(即含有RNA分子发生逆转录所需的所有基本组分的反应混合物)直接去污染，然后当起始逆转录反应(即使反应混合物的温度升高至所选逆转录酶的工作温度，例如50℃或以上)时，该DNase会随着逆转录反应过程(理想的是大多数失活发生在反应的前几分钟)基本不可逆地失活。这种失活的时间过程是至关重要的，因为这意味着新形成的cDNA不会被DNase降解。与具有更高失活温度的DNase不同，这样的DNase不需要单独的失活步骤和/或随后添加逆转录酶。

[0023] 本发明人目前已经制备出了具有这些独特特性的酶。与所有的DNase一样，本发明的极不耐热的DNase通过切割糖磷酸核酸骨架的磷酸二酯键来消化DNA。[0024] 因此，按照本发明，提供了从逆转录反应去除核酸污染的方法，其包括使用这样的DNase，该DNase在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。优选地，这些失活特征在不存在EDTA时实现。

[0025] 本发明的DNase因而用来降解逆转录反应混合物或其单独的组分中所存在的污染的双链DNA。因而，逆转录产物中的污染DNA(如果这样使用逆转录产物，所述污染DNA可能被扩增，从而产生假阳性结果)可被降低或避免，并且非特异性逆转录也可以被降低或避免。

[0026] 具体而言，所述方法包括在允许消化其中的任何双链DNA的条件下将逆转录反应混合物或其单独的组分与本发明的DNase接触，然后将所述反应混合物或其单独的组分加热以使所述DNase失活。优选地，所述反应混合物是完全的反应混合物(即包括DNA引物)，并且优选地，所述完整的反应混合物在与其中所含的逆转录酶的工作温度相应的温度下被加热。

[0027] 在另一实施方案中，所述逆转录反应之后为核酸扩增反应(例如PCR、LCR、SDA、3SR、LAMP)。优选地，PCR、LCR或LAMP在逆转录反应之后。在最优选的实施方案中，所述扩增反应是PCR。

[0028] 在另一实施方案中，以一步法进行逆转录反应和扩增反应，即反应容器同时具有逆转录反应和扩增反应的所有组分。然而，也可以使用两步法。在这些实施方案中，反应和部分反应混合物中的各组分可以用本发明的DNase单独处理。[0029] 换一种方式来看，本发明的这一方面提供了DNase从逆转录反应去除核酸污染的用途，所述DNase在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的，优选地，其中所述逆转录反应之后为核酸扩增反应，例如逆转录-PCR。优选地，DNase的这些失活特征在不存在EDTA时实现。

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如上文所提到的，本发明在防止或基因组DNA污染和残留物，尤其在防止或

降低由残留物和/或基因组DNA污染引起的假阳性结果方面具有特别的用途。[0031] 另一方面，本发明还提供了防止或降低由逆转录反应中的残留物和/或基因组DNA污染引起的假阳性结果的方法，所述方法包括使用这样的DNase来逆转录酶反应混合物或其单独的组分中所存在的污染的基因组DNA和/或残留的双链DNA，该DNase在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。优选地，DNase的这些失活特征在不存在EDTA时实现。

[0032] 本发明的DNase还适用于消除或降低所有扩增反应中的残留物。这是因为DNase的失活温度越低，其在扩增过程中的失活越容易，并且失活步骤中所用的任何给定温度时所获得的失活程度越高，该失活步骤对于dsDNA扩增方案的DNA变性步骤(例如94℃5分钟)是方便的。

[0033] 按照本发明，还提供了从核酸扩增反应去除核酸污染的方法，其包括使用本发明的DNase。

[0034] 本发明的DNase因而用来降解扩增反应混合物或其单独的组分中所存在的非靶标双链DNA。因而，非特异性扩增可以被降低或避免。[0035] 具体而言，所述方法包括在允许消化其中的任何双链DNA的条件下将逆转录反应混合物或其单独的组分与本发明的DNase接触；将所述反应混合物或其单独的组分加热以使所述DNase失活，以及此后使得所述混合物或其单独的组分与待扩增的所述靶核酸接触。

[0036] 换一种方式来看，本发明的这一方面提供了本发明的DNase从扩增反应混合物去除核酸污染的用途。

[0037] 如上文所提到的，本发明在防止或核酸扩增反应中的残留物，尤其在防止或降低由残留物引起的假阳性结果方面具有特别的用途。[0038] 另一方面，本发明还提供了防止或降低由核酸扩增反应中的残留物引起的假阳性结果的方法，所述方法包括使用本发明的DNase来降解扩增反应混合物或其单独的组分中存在的残留非靶双链DNA。

[0039] 本发明的DNase还可以用来从DNA聚合酶制剂去除核酸污染物，以及用来从包含DNA聚合酶的扩增反应混合物去除核酸污染物。本发明DNase的低失活温度意味着，可以在不影响聚合酶或对聚合酶具有极小不利影响的情况下，实现去污染后的DNase的失活。[0040] 本发明尤其适于从所谓的热启动DNA聚合酶去除核酸污染。已开发出许多热启动聚合酶。热启动DNA聚合酶背后的目的是修饰聚合酶，以防止该酶在扩增反应混合物达到接近DNA聚合酶的最佳催化温度的温度之前或者至少在引物退火是足够序列特异的以避免或最小化非特异性扩增的温度时作为DNA聚合酶(延伸所引发的多核苷酸序列的能力)发挥作用。这是因为在较低的温度时，引物能与核酸样品非特异性地退火，并产生非特异性扩增产物，该产物能产生错误的结果和/或对反应具有抑制效应。此外，在某些情况下，聚合酶活性更不精确，并且可能在扩增产物只能够产生序列错误。这种提高的特异性使得热启动聚合酶尤其适用于定量PCR。

[0041] 产生热启动DNA聚合酶的一种方法是将不耐热的基团连接至聚合酶，连接后，其会抑制或阻止该聚合酶的催化作用，但是在温度接近DNA聚合酶的最佳催化温度时，或至

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少在引物退火是足够序列特异的以避免或最小化非特异性扩增的温度时，所述不耐热的基团从该聚合酶解离。

[0042] 合适的不耐热的基团包括聚合酶特异性抗体和亲和体、其它特异的聚合酶结合蛋白、特异的寡核苷酸适体、非特异的包被(例如蜡)和聚合酶氨基酸(例如活性位点中的氨基酸)的共价化学修饰。利用超过热启动聚合酶的热启动激活温度失活的DNase进行这类聚合酶的去污染意味着，热启动聚合酶的热启动特性可能会受到不利影响。有利的是本发明允许利用DNase去除热启动聚合酶制剂中的DNA污染物，并且随后的DNase的失活温度低于典型热启动聚合酶的热启动激活温度，因而可以避免对热启动聚合酶的热启动特性的不利影响。

[0043] 上文所讨论的热启动聚合酶仅仅是进行热启动PCR的一种方法。其它方法是防止一种或多种PCR反应混合物组分与残余组分接触。通常，聚合酶或靶核酸隔离在这样的物质(通常为脂质，例如蜡)之后或之中，该物质的熔点为接近DNA聚合酶的最佳催化温度，或至少为引物退火是足够序列特异的以避免或最小化非特异性扩增的温度。本发明的DNase因而还允许去除这些所谓的“隔离”热启动PCR装置中的核酸污染，而不会对这类热启动PCR造成不利影响。

因此，本发明提供了从热启动PCR去除核酸污染的方法，其中所述反应是隔离热

启动PCR装置和/或涉及热启动DNA聚合酶，该方法包括使用本发明的DNase。

[0045] 本发明的DNase因而用来降解热启动PCR反应装置/混合物中所存在的非靶标双链DNA。因而，非特异性扩增可以被降低或避免。[0046] 具体而言，所述方法包括在允许消化其中的任何双链DNA的条件下将热启动PCR反应装置/混合物与本发明的DNase接触；将所述反应装置/混合物加热以使所述DNase失活，以及此后使得所述待扩增的靶核酸与反应装置/混合物中的剩余组分接触。[0047] 换一种方式来看，本发明的这一方面提供了本发明的DNase从热启动PCR反应去除核酸污染的用途，其中所述反应是隔离热启动反应和/或涉及热启动聚合酶。[0048] 本发明还在防止或热启动PCR反应中的残留物，尤其在防止或降低由残留物引起的假阳性结果方面具有特别的用途，其中所述反应是隔离热启动反应和/或涉及热启动聚合酶。

[0049] 另一方面，本发明还提供了防止或降低由热启动PCR反应中的残留物引起的假阳性结果的方法，其中所述反应是隔离热启动反应和/或涉及热启动聚合酶，所述方法包括使用本发明的DNase来降解热启动PCR反应装置/混合物中所存在的非靶标双链DNA。[0050] 本发明还提供了从热启动DNA聚合酶制剂去除核酸污染的方法，其包括使用本发明的DNase。还提供了本发明的DNase在本方法中的用途。

[0051] 本发明的DNase因而用来降解热启动DNA聚合酶制剂中所存在的双链DNA。具体而言，所述方法包括在允许消化DNA聚合酶制剂中所存在的任何双链DNA的条件下将热启动DNA聚合酶制剂与本发明的DNase接触，然后将所述制剂加热以使所述DNase失活。[0052] 本发明还提供了靶核酸体外扩增、逆转录或热启动PCR扩增的方法，其中所述热启动PCR是隔离热启动反应和/或涉及热启动DNA聚合酶，特征在于所述方法包括在真正的扩增或逆转录反应开始之前，用本发明的DNase处理反应混合物、反应装置或其单独的组分的步骤。

[0044]

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[0053] “逆转录”是通过RNA依赖的DNA聚合酶催化形成与RNA模板互补的DNA分子

(cDNA)的过程。更具体而言，所述聚合酶催化脱氧核苷三磷酸以与所引发的模板RNA序列互补的顺序(即按照Watson-Crick碱基配对原则)发生聚合。[00] 已经鉴定出多种具有催化这种反应能力的酶，并且实例包括但不限于，HIV逆转录酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、C.therm.聚合酶和Tth聚合酶。这些酶具有最佳的工作温度范围。从有机体如感染动物宿主的病毒分离的那些酶的最佳工作温度为约37℃。然而，热稳定的逆转录酶已被鉴定出并且同样可通过突变野生型逆转录酶来产生，并且正是这些热稳定的酶是实验室逆转录酶反应中常用的酶。处在范围最低端的是工作范围为42至60℃的AMV，而Tth DNA聚合酶和C.therm.DNA聚合酶的逆转录酶活性的工作范围分别为55-70℃和60-70℃。

[0055] 最基本的完整的逆转录反应混合物含有逆转录酶、RNA模板、能与模板结合并且逆转录酶可以从其开始聚合的合适的引物、dNTP和合适的缓冲液。在逆转录酶的工作温度孵育混合物会导致cDNA的产生。一旦完成逆转录反应，cDNA可以直接用于测序或基因型分析实验，或者可以用于克隆或检测方案中。[0056] “逆转录酶”表示任何具有逆转录酶活性(即催化与所引发的RNA模板序列互补的DNA对应物发生聚合的能力或RNA依赖的DNA聚合酶活性)的酶。该活性可以是酶的唯一活性，或更通常，该活性可以是酶(例如HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、AMV逆转录酶、Tth DNA聚合酶、C.therm.聚合酶)的组成活性。聚合酶可以具有一般的其它活性包括RNaseH、DNA指导的DNA聚合酶、DNA-RNA解链活性、Mn2+依赖的核酸内切酶。然而，优选的是RNaseH和/或核酸内切酶活性可以最小或不存在。[0057] “逆转录酶制剂”是包含逆转录酶的任何物质，通常为溶液，一般为含水的。具体而言，其指商品化制备的逆转录酶制剂，即可以由实验室酶类供应商提供的逆转录酶试剂，但是本术语还包括这类制剂的稀释、调整和/或修饰形式。逆转录酶制剂还可以是从天然表达逆转录酶的细菌来源和/或包含编码逆转录酶的表达盒的细菌来源获得的逆转录酶制剂。所述制剂可以纯化至与从细菌来源直接获得的初始逆转录酶制剂相当的程度。[0058] 术语“核酸扩增反应”是指用于增加靶核酸序列拷贝数的任何体外方法。优选地，方法涉及“热循环”，即涉及高温循环。扩增方法包括但不限于，PCR及其改进形式、3SR、SDA、LAR或LCR和LAMP以及以上的改进形式。PCR、LAMP和LCR及其改进形式是热循环方法。方法可以导致靶序列拷贝数发生线性或指数增加。“改动形式”包括但不限于实时扩增、定量和半定量扩增、竞争扩增等。取决于所选的扩增方法，靶核酸可以是DNA或RNA。例如，对于PCR，靶标是DNA，但是当与逆转录步骤相结合时，靶标可以被认为是RNA序列。3SR直接扩增RNA靶序列。[0060] 术语“扩增/逆转录反应混合物”是指包含各种用于扩增/逆转录靶核酸的试剂的任何溶液，一般为含水的。这些混合物包含酶、含水缓冲液、盐和核苷三磷酸。该术语是指含有实施成功的扩增反应所必需的所有组分的混合物和不完整的、因而仅含有一些(例如至少2、3或4种)所需组分的混合物。如果以术语“完整的”开头，那么反应混合物含有逆转录和/或扩增所必需的所有组分。[0061] “热启动DNA聚合酶”是已被修饰的DNA聚合酶，通常通过添加不耐热的分子实体以提高所引发DNA多核苷酸可以进行可检测的聚合时的温度。热启动DNA聚合酶可以进行

[0059]

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可检测水平的DNA聚合的温度优选接近聚合酶的最佳催化温度。[0062] 术语“热启动DNA聚合酶制剂”是指包含热启动DNA聚合酶的任何物质，通常为溶液，一般为含水的。具体而言，其指商品化制备的热启动DNA聚合酶制剂，即可以由实验室酶类供应商提供的热启动DNA聚合酶试剂，但是本术语还包括这类制剂的稀释、调整和/或修饰形式。热启动DNA聚合酶制剂还可以是从天然表达聚合酶的细菌来源和/或包含编码聚合酶的表达盒的细菌来源获得的热启动DNA聚合酶制剂。所述制剂可以纯化至与从细菌来源直接获得的初始聚合酶制剂相当的程度。通常，所述制剂还可以经处理以将热启动阻断实体施加到聚合酶上。[0063] “热启动PCR反应”是这样的PCR扩增反应，其中从所引发的DNA多核苷酸的可检测的聚合仅在温度接近聚合酶的最佳催化温度时发生。可检测的聚合的优选温度应当总是结合讨论热启动DNA聚合酶来分析。[00] “热启动PCR混合物”是上文所定义的包含热启动聚合酶的PCR反应混合物。[0065] “隔离(barrier)热启动PCR装置(set up)”是含有PCR反应混合物的两种或更多种组分的反应容器，其中至少一种组分与物质之后或之中的其它组分隔离，所述物质具有与上文所定义的可检测的DNA聚合的温度相应的解链温度。优选地，所述物质是脂质，例如蜡。

[0066] “污染”表示反应混合物中存在这样的核酸，该核酸可以作为逆转录和/或扩增的

模板起作用，却不是逆转录/扩增所靶向的核酸群的一部分。反应混合物中所用的引物不是污染物。[0067] 术语“去除核酸污染”意图涵盖防止或降低核酸污染。[0068] 术语“残留物”用来描述被偶然或无意引入反应混合物中的任何核酸，尤其是来自之前的扩增或逆转录反应所残留的靶序列。[0069] 术语“假阳性结果”是指这样的结果，该结果似乎表明研究中的核酸样品含有靶序列，但是其中所扩增的产物是来源于残留物和/或来源于基因组DNA(就基于逆转录的扩增反应而言)。显然，本发明提供的假阳性结果的降低在法医和诊断领域尤其有利。本发明的方法使得核酸扩增的特异性提高。[0070] 术语“DNase”是指水解DNA骨架中的磷酸二酯键的酶，并且是核苷酸序列非特异性的。

[0071] “基本不可逆地失活”表示加热时，酶至少95％失活、优选98％失活、更优选酶100％失活。可以通过以下方法方便地测量失活百分比：在37℃下在合适的缓冲液(例如Tris、HEPES、PBS)中将DNA样品(例如500bp的PCR产物)与失活的DNase或未失活的DNase一起孵育3小时；通过在溴化乙锭琼脂糖凝胶上的电泳来分离反应产物以及在UV光下测量DNA条带的相对荧光强度(实施例2)。本领域技术人员可以设计出测量失活和未失活DNase的相对活性的备选方法。例如，可以利用含有SYBR green的DNA样品的荧光的相对变化。其它方法是Kunitz测定(Kunitz，M；1950，S.Gen Physiol，33：363和实施例1以及由Yamamoto设计的改进的Kunitz测定(Yamamoto，M；1971，Biochim Biophys Acta，228：95和实施例4)。

[0072]

即便当反应混合物的温度回到室温，DNase也不会重获其活性，并且基本没有残余活性；特别是小于5％，优选小于2％，最优选没有可检测的DNase活性残留。

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基本不可逆地失活优选在50℃或约50℃，例如48至52℃的温度孵育5分钟之内

发生。例如，在50℃孵育1、2或3分钟内。本发明的DNase可以在更低的温度或更短的时间段内发生基本不可逆地失活，但是按照本发明，在约50℃加热5分钟一定足以基本不可逆地使酶失活。本领域技术人员显而易见的是，通过调整两个参数中的一个参数可以补偿其中的另一个。例如，增加失活温度可能允许减少孵育时间。相反，增加孵育时间可允许使用更低的失活温度。例如，本发明的DNase能在55℃的温度孵育1或2分钟内失活，在52℃的温度孵育3分钟内失活、在51℃的温度孵育4分钟内失活，在49℃的温度孵育10分钟内失活或在48℃的温度孵育15分钟内失活。当然，这对本领域技术人员而言也是显而易见的，并且展示在实施例中，当本发明的DNase用在本发明的方法中时，如果实践的话，可以使用长于5分钟的孵育时间，以及可以使用高于50℃的失活温度(例如失活可以发生于50℃、55℃、65℃或94℃各自持续15、30或60分钟；60℃持续15分钟或95℃持续10分钟)。然而，为了符合本发明，如果在50℃或约50℃的温度孵育5分钟，DNase必须表现出基本失活。[0074] 通过将DNase在模拟典型PCR或逆转录酶缓冲液(例如25mM Tris/HCl(pH 8.5)、5mM MgCl2)的溶液中孵育应该能评估DNase的失活温度和时间。应当优选不存在EDTA。DNase应当以约0.01U/μl至10U/μl存在，优选0.05至5U/μl，例如0.5至1.5U/μl。在任何给定温度时的失活可以通过在失活缓冲液中存在二硫键还原剂(即抑制和/或破坏蛋白中两个或更多个半胱氨酸残基间的二硫键的试剂)在程度和/或速度方面增强。这类试剂的实例包括但不限于，DTT、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺·HCl、TCEP·HCl(Tris(2-羰基乙基)膦酸盐酸、N-乙基马来酰亚胺。DTT是优选的。可选地，二硫键还原剂(例如DTT)可用来降低失活步骤具体持续时间所需的失活温度。本领域技术人员能够确定为了满足其提高失活但是对下游反应不会不利而需要的合适浓度的二硫键还原剂。例如，可以方便地以0.05至50mM的浓度将DTT掺入失活步骤。DTT通常以1至10mM的浓度用在逆转录反应中，并且通常用在PCR反应中。[0076] 优选地，本发明方法中的DNase的失活在DTT浓度为0.1至10mM，优选为0.5至5mM，最优选为1至2mM时发生。对于失活温度的标准评估，优选使用25mM Tris/HCl(pH 8.5)、5mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液。

[0077] 线性双链DNA和超螺旋环状DNA两者均是本发明酶的底物。该酶对于单链DNA如扩增/逆转录酶引物具有较小的、可以忽略的或基本没有可检测的活性。换句话而言，DNase基本对双链DNA是特异的。[0078] “基本对双链DNA特异”表示在浓度为0.01至0.05U/μl时，DNase切割双链DNA，但是对单链DNA具有较小的、可以忽略的或基本没有可检测的活性。优选地，在这些浓度时，对单链DNA没有可检测的活性。本领域技术人员能够容易地设计实验来比较DNase对单链和双链DNA的相对活性。Anisimova等(BMC Biochemistry，2008，9：14)公开了这样的实验。简单而言，在测试下，在50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2(30μl终反应体积)中将2Kunitz单位的DNase与M13噬菌体DNA(单链的)或λ噬菌体DNA(双链的)一起孵育1小时，并在溴化乙锭琼脂糖凝胶上分离产物。通过条带相对于未处理对照的位置来观察针对单链和/或双链DNA的活性。另一方法在实施例6中详述。在该方法中，可以通过测量来自寡核苷酸的荧光增加来测试DNase对双链和单链DNA的特异性，所述寡核苷酸的

[0075]

5′末端标记有荧光团FAM(荧光素)，3′末端标记有TAMRA。当两个标记物接近时，从FAM

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发射的光被TAMRA吸收(淬灭)。寡核苷酸被DNase切割导致FAM与TAMRA分离，并导致来自FAM的荧光增加，所述荧光可以在激发波长为485nm和发射波长为520nm的荧光计中测量。通过将标记的寡核苷酸与第二寡核苷酸混合来制备双链DNA底物，所述第二寡核苷酸与所标记的寡核苷酸互补。当然，同样可以使用其它合适的荧光团对。[0079] 就逆转录反应而言，这些特征允许包含RNA样品、引物、核苷酸、逆转录酶和缓冲液的逆转录反应混合物(即完整的反应混合物)中含有DNase，并且例如在室温下快速降解残留物质和基因组DNA。这些特征还允许在完全基于一步逆转录的扩增反应混合物中含有DNase。

[0080] 这些特征还允许在包含引物、核苷酸、DNA聚合酶和缓冲液的扩增反应混合物中含有DNase，并且例如在室温下快速降解残留物质。[0081] 有利的是，本发明的不耐热的DNase在完整的扩增反应混合物中是全功能性的，并且与标准体外扩增试剂和条件兼容。该酶还应当能够从反应混合物去除适量的污染基因组DNA和/或残留物，通常为fg或pg水平，但是优选多达1ng。优选地，DNase能够在室温下5分钟内，更优选3分钟内，最优选2分钟内降解所有残留物。

[0082] 将反应混合物的温度升高至本发明的DNase的失活温度(约50℃)，持续短时间(例如5分钟)会不可逆地使本发明的DNase失活。

就逆转录反应而言，这可以方便地与逆转录步骤伴随进行。就DNA扩增反应(包

括热启动PCR)而言，可以随后添加待扩增和分析的核酸样品(即靶核酸)，并开始扩增。即便当反应混合物的温度在热循环期间和在扩增或逆转录之后降低了，靶序列的拷贝也不会被降解，因为DNase已被不可逆地失活。本发明的具体优点是当去污染和随后的失活步骤发生时，逆转录和/或扩增反应混合物中可以含有逆转录酶和/或DNA聚合酶。这是由于导致DNase失活的条件温和(约50℃持续5分钟)，所以可以进一步去除潜在的污染源。[0084] 优选地，DNase对DNA:RNA双螺旋的DNA链具有最低的核酸酶活性。“最低的”表示DNase对DNA:RNA双螺旋的DNA链的核酸酶活性小于其对双链DNA的活性的40％。优选地，DNase对DNA:RNA双螺旋的活性小于其对双链DNA的活性的30％或20％。[0085] 正是本发明的优选DNase的这些具体特征(即快速基本不可逆地失活、双链特异性，以及优选地，最低的DNA:RNA双螺旋核酸酶活性)使得这些DNase特别适于一步逆转录扩增方案的去污染。这是因为可以在一步和不需要添加其它物质的条件下，使整个反应混合物去污染，而不用担心扩增或逆转录产物发生不想要的降解。这使得污染风险(包括基因组DNA污染)最小化，并且不会通过初始逆转录产物和/或扩增产物的不想要的消化损失敏感度。

[0086] 用于上述方法中的DNase酶本身构成了本发明的另一方面。因而，本发明的这一方面提供了在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的DNase。优选地，这些失活特征在不存在EDTA时实现。

[0087] 尽管具有上述特征的任何不耐热的DNase明显都可以适用于本发明的方法，但是来源于北极甜虾DNase的修饰DNase或来源于其它生物体(优选海洋生物)的相似DNase组成本发明的另一方面，其中特定的脯氨酸残基被修饰、缺失或取代。所述生物体可以是原核生物或真核生物。“原核生物”表示没有细胞核的任何生物，即来自真细菌域和古细菌域的任何生物体。优选地，所述生物体是细菌。更优选地，所述生物体是真核生物，例如

[0083]

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分类到动物界、植物界、真菌界或原生生物界分类学界的生物体，例如以下动物门分界的生物体：棘头动物门、无腔动物门、环节动物门、节肢动物门、腕足动物门、苔藓动物门、毛颚动物门、脊索动物门、刺胞动物门、栉水母动物门、环口动物门、棘皮动物门、螠虫动物门、内肛动物门、腹毛动物门、颚胃动物门、半索动物门、动吻动物门、铠甲动物门、微颚动物门、软体动物门、线虫动物门、线形动物门、纽形动物门、有爪动物门、直泳虫门、帚形动物门、扁盘动物门、扁形动物门、多孔动物门、鳃曳动物门、菱形虫门、轮虫动物门、星虫动物门、异涡动物门、角苔植物门、苔藓植物门、地钱植物门、石松植物门、蕨类植物门、种子蕨门、松柏植物门、苏铁植物门、银杏植物门、买麻藤植物门、有花植物门(或被子植物门)、壶菌门、半知菌门、接合菌门、球囊菌门、子囊菌门或担子菌门。来自动物界的生物体，例如无脊椎动物和脊椎动物是重要的。更优选选自节肢动物门的那些生物体，例如甲壳亚门、六足亚门、螯肢亚门或多足亚门的生物体，例如甲壳亚门的鳃足纲、桨足纲、头虾纲、颚足纲、介形纲或软甲纲的生物体，优选软甲纲，且更优选十足目的生物体。生物体可以分类到长额虾科，例如Anachlorocurtis属、Atlantopandalus属、Austropandalus属、Calipandalus属、Chelonika属、Chlorocurtis属、绿点虾属、Chlorotocus属、Dichelopandalus属、Dorodotes属、异腕虾属、Miropandalus属、Notopandalus属、Pandalina、拟长额虾属、长额虾属、Pantomus属、Peripandalus属、红虾属、Procietes属、Pseudopandalus属或Styiopandalus属；石蟹科，例如Cryptolithodes属、Glyptolithodes属、石蟹属、Lopholithodes属、新岩蟹属、拟石蟹属、仿岩蟹属、Phyllolithodes属或Rhinolithode属；或者对虾科，例如对虾属、明对虾属、Litopenaeus属或囊对虾属。所述生物体优选是已经进化出栖息于寒冷环境如寒冷的海洋环境或水环境中的生物体。所述生物优选选自例如堪察加拟石蟹(帝王蟹)、日本囊对虾(斑节虾)或日本对虾。在其它实施方案中，DNase来自这样的生物物种，该生物物种并非原核生物，如并非细菌，如并非嗜冷菌。[0088] 本发明的范围内还包括这些修饰DNase的酶的活性片段。[00] 因此，另一方面，本发明提供了DNase或其酶活性片段，所述DNase具有SEQ ID No.1的序列或具有与SEQ ID No.1至少60％，优选至少70％、80％、90％或95％，例如至少98％同一性的序列，但是其中SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸残基或其它序列中的等同脯氨酸已被修饰、缺失或取代，所述DNase或其酶活性片段在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。[0090] SEQ ID NO：1是北极甜虾DNase的cDNA的翻译部分的氨基酸序列。所述cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。SEQ ID NO：1包含信号肽序列MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG(SEQ ID NO：9)。北极甜虾DNase的成熟形式如SEQ ID NO：5所示(即SEQ ID NO.1的无信号肽(SEQ ID NO：9的序列)。因此，SEQ ID NO：1的237位残基脯氨酸与SEQ ID NO：5的214位残基脯氨酸是同一位置。

因此，本发明还提供了DNase或其酶活性片段，所述DNase具有SEQ ID No.5的序

列或具有与SEQ ID No.5至少60％，优选至少70％、80％、90％或95％，例如至少98％同一性的序列，但是其中SEQ ID No：5的第214位的脯氨酸残基或其它序列中的等同脯氨酸已被修饰、缺失或取代，所述DNase或其酶活性片段在约50℃的温度加热5分钟会基本不可逆地失活并且基本对双链DNA是特异的。

[0092] SEQ ID No.1的酶活性片段或变体表现出至少70％，优选至少85％，更优选至少

[0091]

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95％且最优选至少99％的SEQ ID No.5的成熟酶的酶功能(即无核苷酸序列特异性地水解DNA骨架中的磷酸二酯键的能力)。如其它地方所讨论的，利用常规技术能容易地评估DNase的活性。

[0093] 可以利用任何可广泛获得的算法(例如利用Clustal W2多重序列比对程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2)，使用默认参数(DNA空位开放罚分＝15.0；DNA空位延伸罚分＝6.66；DNA矩阵＝Identity；蛋白空位开放罚分＝10.0；蛋白空位延伸罚分＝0.2；蛋白矩阵＝Gonnet；蛋白/DNAENDGAP＝-1；蛋白/DNA GAPDIST＝4)来计算本发明的百分比序列同一性。

[0094] 与SEQ ID No.1或5相比的“其它序列中的等同脯氨酸”，能通过利用标准序列比对技术如Clustal W2所产生的诸如图11中所表示的比对容易地鉴别出。[0095] 优选地，本发明的DNase或其片段具有获自分类到上文所提到的任何分类学类别中的物种的DNase的序列，例如来自节肢动物门或甲壳亚门、六足亚门、螯肢亚门和多足亚门，例如北极甜虾、堪察加拟石蟹(帝王蟹)、日本囊对虾(斑节虾)或日本对虾，但是其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。优选来自北极甜虾的DNase，其中与SEQ ID No 1的第237位的脯氨酸等同的脯氨酸残基已被修饰、缺失或取代。

[0096] 在最优选的实施方案中，本发明的DNase具有SEQ ID NO：3或7的氨基酸序列。[0097] 脯氨酸的“取代”(例如SEQ ID NO：1的237位残基/SEQ ID NO：5的214位残基)表示脯氨酸残基由另一天然存在的氨基酸，通常为遗传编码的或氨基酸类似物替代。优选地，脯氨酸由丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸替代。[0098] 脯氨酸的“修饰”表示改变脯氨酸残基的常见立体化学特性，例如通过利用不同的基团替代其侧链，修饰侧链本身的组成或用不同的侧链基团替代侧链相对的氢。[0099] 本发明还提供了编码本发明DNase的核酸分子。与SEQ ID NOs：3和7的氨基酸序列对应的核苷酸序列在SEQ ID NOs：4和8中公开。遗传密码的简并性表示SEQ ID NOs：4和8仅是多种可能的核苷酸序列中的两种。

[0100] 本发明还提供了上文所述的特定DNase在核酸扩增方法中作为去污染剂的用途。上文所述的特定DNase在在此所示的去污染方法中的用途代表了本发明的特别优选的实施方案。

[0101] 用于分离和纯化上文所述的DNase或其酶活性片段的方法代表了本发明的另一方面。因此，在本方面中，本发明提供了这样的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞(例如毕赤酵母；大肠杆菌；酿酒酵母、杆状病毒感染的昆虫细胞)中表达所述DNase或其片段，以及随后从所述宿主细胞和/或培养所述细胞的培养基中分离DNase。可以通过将编码所述DNase或其片段的表达载体并入合适的宿主细胞来实现所述DNase或其片段的表达，例如包含编码SEQ ID NOs：3和7的氨基酸序列的核酸分子(例如包含SEQ ID NOs：4或8的核苷酸序列的核酸分子)的表达载体。本发明包括包含这些表达盒和核酸分子的宿主细胞。

[0102] 可以利用本领域内已知的和文献中公开描述的任何蛋白纯化技术或以上的任何组合从宿主细胞/培养基分开或分离DNase酶。这类技术可以包括例如，沉淀、超滤、透析、各种层析技术如凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、电泳、离心等。

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同样，还可以利用本领域内公知的技术如均化、冻融等来制备宿主细胞的提取物，

并且可以从该提取物纯化出本发明的DNase。[0104] 已经发现，基于例如在琼脂糖凝胶柱如红色琼脂糖凝胶(Pharmacia Biotech，Sweden)或蓝色琼脂糖(GE Healthcare)凝胶柱上的离子交换层析和亲和层析组合的纯化方案可易于用来分离酶。[0105] 更具体而言，可以将提取物进行离子交换层析，并用NaCl梯度洗脱蛋白。可以将含有DNase活性的级分进行透析，然后在最后用NaCl洗脱之前将所述级分施加到亲和柱上。

[0106] 本发明还提供了包含至少本发明的DNase的试剂盒。所述试剂盒还可以含有实施核酸扩增和/或逆转录反应所必需的一些或全部试剂、缓冲液、酶等。更具体而言，所述试剂盒可以含有核苷三磷酸(包括用于SDA的dNTPαS)、寡核苷酸引物、逆转录酶(优选那些能在约50℃发挥功能的酶)、DNA聚合酶(优选热稳定聚合酶如Taq聚合酶或Bst聚合酶(及其热启动形式))，或在LAR情况下，DNA连接酶(优选热稳定DNA连接酶如Ampligase或US6280998中所公开的分离自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的连接酶)或性酶(优选热稳定性酶如BsoB1)。可以将DNase与逆转录酶、DNA聚合酶、链置换聚合酶或LCR连接酶一起在一个隔室中提供。

本发明还提供了包含本发明的DNase和一种或多种实施核酸扩增和/或逆转录反

应和方法所必需的试剂(例如上文所述的那些组分)的组合物。通常，这类组合物是含水的，并是用标准缓冲液如Tris、HEPES等缓冲。[0108] 逆转录方法目前在本领域内当然是标准，并且可以用任何已知或标准试剂和技术来实现。

[0109] 在典型的逆转录方案中，去污染步骤可以简单地涉及在短时间内孵育包含DNase的逆转录反应混合物，例如室温孵育1至30分钟，方便的为2至15分钟。该孵育时间不是关键的，并且可以根据确切的DNase和所用的浓度以及反应系统中的其它组分来改变。所述温度可以为任何温度，酶在该温度下是活性的，即低于失活温度(例如37℃)，但是室温是方便的。

[0110] 如上文所提到的，这类反应混合物可以含有逆转录反应所必需的所有试剂。[0111] 典型的代表性逆转录混合物可以例如含有：

[0107] [0112]

[0113]

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在上述代表性实例中，可以使用无菌蒸馏水与实验模板体积的任何组合，只要反

应总体积(包括缓冲液、dNTP、引物、酶和MgCl2溶液)等于50-100μl。然而，可以根据选择使用可选的终体积，以获得例如反应物的相似的或其它期望的终浓度。可以使用任何方便的或商购的逆转录缓冲液。合适的5倍逆转录缓冲液可以为250mM Tris-HCl(在25℃时

150mM KCl、5mM DTT。逆转录缓冲液可以从Fermentas购买。pH8.5)、40mM MgCl2、

[0115] 根据潜在的污染程度，所需DNase的量可以不同。在短的孵育步骤(室温下0-15分钟)中，2.0单位/50μl反应混合物通常是足够的。0.1至2.0单位/50μl反应混合物是合适的，并且活性约0.5单位/50μl反应混合物(例如0.2至1.0单位/50μl反应混合物)是优选的。在浓度为2.0单位/50μl反应混合物时，观察到一些ssDNase活性，因此优选上文列出的活性。一单位酶定义为在Kunitz测定或Yamamoto改进的Kunitz测定(两者均同上)中，在260nm处每分钟吸光度增加0.001的酶量。孵育后，通过加热反应混合物使DNase失活。方便地，这可以通过在逆转录步骤中加热，例如约50℃持续30分钟来实现。

[0116] 方便地，包括利用本发明的DNase的去污染步骤的扩增方法涉及或基于PCR。PCR方法在本领域内是标准，并且可以用任何已知或标准试剂和技术来实施。[0117] 在典型的PCR反应方案中，去污染步骤可以简单地涉及短时间内孵育包含DNase的扩增反应混合物，例如室温孵育1至10分钟，方便的为2至15分钟。该孵育时间不是关键，并且可以根据确切的DNase和所用的浓度以及反应系统中的其它组分来改变。所述温度可以为任何温度，酶在该温度下是活性的，即低于失活温度(例如37℃)，但是室温是方便的。

[0114]

如上文所提到的，这类反应混合物可以含有除了模板(即待扩增的靶核酸)之外

扩增反应所必需的所有试剂。

[0119] 典型的代表性PCR扩增反应混合物可以例如含有：

[0118] [0120]

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在上述代表性实例中，可以使用无菌蒸馏水与实验模板体积的任何组合，只要反

应总体积(包括缓冲液、dNTP、引物、酶和MgCl2溶液)等于25-50μl。然而，可以根据选择使用可选的终体积，以获得例如反应物的相似或其它所需的终浓度。可以使用任何方便的或商购的PCR缓冲液。[0122] 去污染后，通过加热反应混合物使DNase失活。方便地，这可以通过在第一个PCR循环中加热来实现。

[0123] PCR过程的最佳性能受所选择的温度、处于某温度的时间和循环中每一步骤的温度之间的时间长度的影响。在新鲜添加的靶核酸进行PCR扩增之前，利用DNase来降解污染的ds DNA的典型循环概况如下：(a)DNase于室温孵育0至10分钟；(b)DNase于94℃失活2分钟；(c)添加模板；DNA于94℃解链1分钟；(d)引物于50-65℃退火15秒；(e)引物于72℃延伸30秒；(f)DNA于94℃解链10秒；以及按需要多次重复步骤(d)-(f)，以获得所

[0121]

期望的扩增水平。

[0124] 如之前所提到的，本发明的DNase尤其适于一步逆转录扩增反应，例如逆转录PCR。这些方案在本领域内沿用已久，但是为了完整性，典型的代表性逆转录PCR混合物可以例如含有：

[0125]

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[0126]

上述关于逆转录和PCR反应中的体积和缓冲液的讨论适用于此。去污染后，在

DNase失活的温度(例如50℃持续1小时)进行逆转录酶反应。在该步骤中，使DNase失活。这表示，随着cDNA产物产生其不会被降解，并且当PCR反应开始时，同样不会降解其产物。逆转录反应之后，PCR反应无需再一次添加反应混合物，通过将反应容器暴露于上文所述的循环概况即可进行。附图说明

通过非性的实施例并结合以下附图来描述本发明，其中：

[0128] 图1展示了多幅琼脂糖凝胶图片，其表明SEQ ID NO：7的DNase和野生型北极甜虾DNase(SEQ ID NO：6)的活性，这些DNase在存在或不存在DTT时于50、55、65或94℃持续失活15、30或60分钟，对比质粒DNA于37℃持续3小时。[0129] 图2展示了SEQ ID NO：7的DNase在存在DTT时于55℃失活的时间过程。[0130] 图3展示了SEQ ID NO：7的DNase在存在DTT时于50℃失活的时间过程。

[0131] 图4展示了本发明的成熟形式的P214A突变的北极甜虾DNase的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。

[0132] 图5展示了成熟形式的P214A突变的北极甜虾DNase的编码核苷酸序列(SEQ ID No.8)。

[0133] 图6展示了本发明的P237A突变的北极甜虾DNase的核苷酸序列和氨基酸序列

[0127]

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(SEQ ID NO：3和4)。该氨基酸序列包含信号肽MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG(SEQ ID NO：9)。[0134] 图7展示了成熟形式的北极甜虾DNase的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。[0135] 图8展示了成熟形式的北极甜虾DNase的编码核苷酸序列(SEQ ID No.6)。

[0136] 图9展示了北极甜虾DNase的cDNA核苷酸序列和所翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：1和2)。该氨基酸序列包含信号肽MIGRTTFIALFVKVLTIWSFTKG(SEQ ID NO：9)。图10展示了野生型北极甜虾DNase和P214A突变体对一步RT-PCR效率的影响。[0138] 图11展示了帝王蟹(堪察加拟石蟹)DNase(SEQ ID No.15)和北极甜虾DNase(SEQ ID No.5)的氨基酸序列比对。在379个残基重叠中具有65.7％的同一性；评分：1384.0；空位频率：0.0％。

[0139] 图12展示了浓度渐增的P214A突变体对定量PCR方案的影响。

[0140] 图13展示了通过测量热处理的酶对定量PCR方案的抑制性效应比较DNase I和P214A突变体的不耐热性。

[0141] 图14展示了随着量渐增的P214A突变体从定量PCR反应混合物去除掺入的DNA的程度。

[0142] 图15展示了浓度渐增的P214A突变体对一步RT-PCR反应的影响。[0143] 图16展示了P214A突变体对无模板的qPCR对照的影响。[0144] 并且其中

[0145] SEQ ID No.1是北极甜虾DNase的cDNA核苷酸序列的翻译部分的氨基酸序列。[0146] SEQ ID No.2是北极甜虾DNase的cDNA核苷酸序列。

[0147] SEQ ID No.3是P237A突变的北极甜虾DNase的氨基酸序列。[0148] SEQ ID No.4是P237A突变的北极甜虾DNase的编码核苷酸序列。[0149] SEQ ID No.5是成熟形式的北极甜虾DNase的氨基酸序列。[0150] SEQ ID No.6是成熟形式的北极甜虾DNase的编码核苷酸序列。

[0151] SEQ ID No.7是成熟形式的P214A突变的北极甜虾DNase的氨基酸序列。[0152] SEQ ID No.8是成熟形式的P214A突变的北极甜虾DNase的编码核苷酸序列。[0153] SEQ ID No.9是北极甜虾DNase的信号肽的氨基酸序列。

[01] SEQ ID No.10是为测量DNase活性而用5′FAM和3′TAMRA标记的寡核苷酸。[0155] SEQ ID No.11是SEQ ID No.10的互补序列。

[0156] SEQ ID No.12是用于扩增大肠杆菌23SrRNA基因片段的正向引物。

[0137]

SEQ ID No.13是用于扩增大肠杆菌23SrRNA基因片段的反向引物。

[0158] SEQ ID No.14是位于SEQ ID No.13和SEQ ID No.14互补区域之间的与大肠杆菌23SrRNA基因片段互补的5′FAM和3′BHQ标记的寡核苷酸探针。

[0159] SEQ ID No.15是帝王蟹(堪察加拟石蟹)DNase的氨基酸序列。[0160] 序列表的自由文字[0161] SEQ ID No.10

[0162] <223>用于测量DNase活性的5′FAM和3′TAMRA标记的寡核苷酸探针。[0163] SEQ ID No.11

[01] <223>SEQ ID No.10的互补序列。[0165] SEQ ID No.12

[0157]

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CN 102510904 A[0166] [0167] [0168] [0169] [0170]

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<223>用于扩增大肠杆菌23SrRNA基因片段的正向引物。SEQ ID No.13

<223>用于扩增大肠杆菌23SrRNA基因片段的反向引物。SEQ ID No.14

<223>位于SEQ ID No.13和SEQ ID No.14互补区域之间的与大肠杆菌23SrRNA

基因片段互补的5′FAM和3′BHQ标记的寡核苷酸探针。[0171] 实施例1-DNase活性的测量[0172] Kunitz测定[0173] DNase活性可以按照Kunitz方法(Kunitz，M.，1950，Crystalline Deoxyribonuclease，II，Digestion of Thymus Nucleic Acid.The Kinetics ofReaction(结晶脱氧核糖核酸酶，II，胸腺核酸的消化，反应动力学).J.Gen.Physiol.，33，363-377)进行测定。将10μl酶制剂添加到100mM醋酸钠(pH 5.0)、5mM MgCl2中的50μg小牛胸腺DNA中，终体积为1ml。混合物于25℃孵育，并在260nm处测量吸光度的增加。1U＝0.001OD260增加×分钟-1。[0174] Yamamoto改进的Kunitz测定[0175] 由Yamamoto(Yamamoto，M.1971.Purification and some properties of an acid deoxyribonuclease from testes of Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha(来自大鳞大麻哈鱼即三文鱼睾丸的酸性脱氧核糖核酸酶的纯化及一些特征).Biochim Biophys Acta，228，95-104)所述的改进的Kunitz测定，即终点测定是Kunitz测定的更灵敏形式，并且被认为更适合于测量失活后的残留DNase活性。将10μl酶制剂添加到20mM Tris/HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2中的200μg小牛胸腺DNA中，终体积为1ml。将混合物于37℃孵育20分钟。然后添加0.5ml冰冷的12％的HClO4，充分混合，并在冰上静置20分钟。将管在Eppendorf离心机上全速离心10分钟。测定260nm处的吸光度，并由其计算出单位。1U＝0.001OD260增加×分钟-1。

[0176] 实施例2-北极甜虾DNase的突变TM

[0177] 利用Invitrogen的Quick-change突变试剂盒和厂商说明书使北极甜虾DNase(SEQ ID No.5)214处的残基(对应于SEQ ID No 1237处残基)发生突变。脯氨酸是野生型残基，丙氨酸是替换残基。图4至图9展示了北极甜虾DNase的野生型和突变形式的氨基酸和核苷酸序列。对突变体进行测序，找到正确的并转化入毕赤酵母中。获得显示出与野生型相似的表达良好的转化体。最初在P214A突变体上的失活测试表明，P214A突变体在55℃时比野生型DNase更容易失活。

然后，使含有突变的P214A DNase表达盒的重组毕赤酵母克隆在1L发酵罐中表

达。如Invitrogen的毕赤酵母属发酵法指南所描述的进行发酵。在4500g下将发酵液(大约1L)离心15分钟以去除细胞，然后将上清液倒入新的瓶子。接着通过添加0.5M NaOH将pH调至8，然后在4500g下离心15分钟以去除沉淀的盐。最后通过Whatman GF/F过滤器过滤新的上清液。[0179] 最初，用阴离子交换层析法纯化P214A DNase蛋白。调整pH，并将过滤的上清液(1150ml)施加到Q-琼脂糖凝胶FF柱(2.6/10)上，该柱已用25mM Tris/HCl(pH 8)、5mM MgCl2、0.25M NaCl(缓冲液A)平衡。接着用19个柱体积的缓冲液A冲洗柱子，然后用缓冲

[0178]

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液25mM Tris/HCl(pH 8)、5mM MgCl2、0.5M NaCl洗脱P214A蛋白。收集10ml的级分。所用流速为10ml/分钟。通过根据实施例1中所描述的Kunitz方法测量活性，来选择含有P214A蛋白的级分。

[0180] 将所选级分合并，并在4℃下于10mM Tris/HCl(pH7.5)、5mM MgCl2(缓冲液B)中透析。用相同的缓冲液将透析样品的体积调至200ml，然后施加到蓝色琼脂糖凝胶FF柱(5.0/10)上，该柱已用缓冲液B平衡。用2个柱体积的缓冲液B冲洗柱子，用缓冲液B+0.25M NaCl洗脱P214A DNase蛋白，并收集10ml的级分。所用流速为10ml/分钟。最后，通过以上所述测量活性来选择含有P214A的级分、合并并浓缩。[0181] 实施例3 对不同温度下失活后的残余活性的测定[0182] 为了确定P214A突变体通过加热是否完全失活，对在加热失活的P214A突变体或野生型酶存在下的PCR产物的完整性进行评估。

[0183] 将酶(0.8U P214A或1.5U wt)添加到含有总体积为20μl的25mM Tris/HCl(pH8)、5mM MgCl2±1mM DTT缓冲液的PCR管中。在不同的温度下将酶加热失活15、30和60分钟，然后将管置于冰上。添加0.5μg纯化的～500bp PCR产物，并使反应于37℃孵育3小时。最后，利用琼脂糖凝胶电泳分析反应。以与上述反应相似的方式处理阴性对照(无酶)和阳性对照(加热失活步骤后，添加稀释100倍的酶)。[0184] 图1总结了在50℃、55℃、65℃和94℃下与野生型酶相比的P214A突变体的加热失活实验。无酶对照(-)显示完整的PCR产物，而阳性对照(+)，即没有被加热失活的稀释100倍的酶展示出1％残余活性作用。[0185] 从对照实验，没有PCR产物的明显降解，这表明残余活性小于0.01％(结果未显示)，这是使用约～1U酶的测定中的检测极限。在50℃和55℃下，只有P214A突变体被完全加热失活，这表明P214A取代物的作用。添加DTT(本实验中为1mM)对于两种酶的完全失活是必需的。只有当在94℃孵育60分钟时，才能看到在不存在DTT时的完全加热失活。[0186] 实施例4 P214A在50℃和55℃下失活的时间过程[0187] 如果使用DNase使完整的逆转录酶反应混合物去污染，则重要的是在逆转录酶步骤的早期使DNase失活。如果核酸酶没有被尽快失活，那么它可能会开始切割cDNA，并对逆转录产物具有不利影响。如果逆转录是用于测量样品中RNA的量的定量测定中的一部分，则这更加重要。因此，测试使P214A突变的DNase在50℃和55℃下失活的更短的时间点。[0188] 将12.5-125U的P214A稀释于典型的RT-缓冲液(50mM Tris/HCl(pH 8.3)、50mM KCL、5mM MgCl2、5mM DTT)中，总体积为25μl。使样品于50℃和55℃下在PCR仪器中孵育0-5分钟。然后利用实施例1中所述的改进的Kunitz测定测量残余活性。[01] 如图2和图3所示，P214A突变体在55℃下1分钟内可以完全失活，而且在50℃下1分钟内几乎完全失活。

[0190] 实施例5 野生型北极甜虾DNase和P214A突变体对一步RT-PCR效率的影响[0191] 利用Brilliant QRT-PCR Master Mix 1-步试剂盒(Stratagene)进行一步qRT-PCR扩增反应，并在Smart Cycler II(Cepheid)中进行热循环和检测。[0192] 反应混合物(25μl)含有12.5μl 2倍QRT-PCR master mix、1.25μl 20倍引物/探针混合物(GAPDH HS99999905ml，Applied Biosystems)、0.1μl Stratascript逆转录酶、1μl DNase酶。使用1μl(1ng/μl)Stratagene QPCR人参照总RNA(Stratagene)作为

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模板。每个反应混合物于30℃预热15分钟。然后按以下进行一步逆转录PCR：50℃ 30分钟、95℃ 10分钟、之后45个循环的94℃ 15秒、60℃ 1分钟。[0193] 如图10所示，观察到含有P214A突变体的样品对RT-PCR效率具有很小的影响或没有影响，另一方面，野生型核酸酶严重影响RT-PCR的效率。[0194] 实施例6 ds/ssDNA对P214A的特异性的分析[0195] 通过检测来自寡核苷酸的荧光，来测试双链和单链DNA对P214A的特异性，所述寡核苷酸的5′末端标记有荧光团FAM(荧光素)，3′末端标记有TAMRA。寡核苷酸由核酸酶切割会导致来自FAM的荧光提高，所述荧光在激发波长为485nm和发射波长为520nm的荧光计中测量。通过将标记的寡核苷酸与第二寡核苷酸混合来制备双链DNA底物，所述第二寡核苷酸与所述标记的寡核苷酸互补。[0196] 向含有50mM Tris/HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2和0.2μM标记的寡核苷酸(DNAsub)的反应混合物添加37单位的P214A突变体(总体积100μL)。将混合物在25℃下在白孔微量滴定板中孵育，用于荧光检测。[0197] 同样，向如上所述的反应混合物添加0.2μM互补的寡核苷酸compDNAsub，以形成双链DNA底物。然后向反应混合物添加0.01单位P214A突变体。

在Victor3仪器中随时间测量荧光，并将活性计算为初始每分钟增加的荧光，用

无核酸酶(空白反应)下的荧光增加来校正，并表示为(荧光单位/分钟)/Kunitz单位。[0199] 对于双链DNA底物，结果是211,922(荧光单位/分钟)/Kunitz单位，而对于单链DNA底物，结果是10.4(荧光单位/分钟)/Kunitz单位。因此，双链DNA底物以比单链DNA更快20,366的速率被降解。[0200] 寡核苷酸：[0201] DNAsub：5′-FAM-CGCCATCGGAGGTTC-TAMRA-3′[SEQ ID NO：10][0202] compDNAsub：5′-GAACCTCCGATGGCG-3′[SEQ ID NO：11][0203] 实施例7 利用P214A突变体进行qPCR的去污染[0204] 材料和方法[0205] 利用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)分离大肠杆菌TOP10基因组DNA，并用Quant-iT dsDNA BR检测试剂盒和Qubit荧光计(Life Technologies)来检测DNA浓度。为了利用定量PCR(qPCR)检测大肠杆菌基因组DNA并对其进行定量，使用小范围内高度保守的23S rRNA基因如(Smith GJ III等；1999；Biotechniques 26(3)：518-22，524，526)中所描述来设计引物/探针组。该基因在大肠杆菌基因组中存在7个拷贝。[0206] 通常，在Smart Cycler II(Cepheid)中以25μl反应进行qPCR，所述25μl反应含有12.5μl 2倍Brilliant qPCR master mix(Stratagene)或TaqMan Gene Expression master mix(Applied Biosystems)、3μM的各引物和1μM的探针、1mM DTT、1或10pg大肠杆菌基因组DNA和各种量的P214A突变的酶或DNaseI(Sigma)。按下述进行qPCR反应：95℃ 10分钟、之后为40个循环的95℃ 15秒和60℃ 1分钟。[0207] 引物/探针：

[0208] 大肠杆菌_23S_正向：5′-GAAAGGCGCGCGATACAG-3′[SEQ ID No.12][0209] 大肠杆菌_23S_反向：5′-GTCCCGCCCTACTCATCG A-3′[SEQ ID NO.13][0210] 大肠杆菌_23S_探针：5′-FAM-CCCCGTACACAAAAATGCACATGCTG-BHQ-3′[SEQ ID

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NO.14]

P214A突变体对引物/探针完整性(ssDNA)的影响[0212] 本实验测试P214A突变体是否会通过降解qPCR混合物中的引物/探针(即降解单链DNA)而对qPCR方案具有抑制性影响。

[0213] 按上文所述设置反应混合物(Brilliant qPCR master mix)，不加模板(大肠杆菌

[0211]

基因组)DNA，并于37℃孵育10分钟。在添加10pg大肠杆菌基因组DNA作为模板之前，进行95℃ 10分钟的失活步骤。然后，如上文所述进行qPCR扩增。

[0214] 37℃的孵育步骤允许P214A突变体催化DNA的降解。在添加模板DNA之前，95℃孵育10分钟使该突变体完全失活。因而，qPCR结果的任何抑制仅是由于针对ssDNA的核酸酶活性(引物/探针已被降解)。如图12所示，通过添加高达1U的P214A突变体，qPCR结果没有受到影响，这表明没有可检测的针对qPCR反应混合物中的引物/探针的活性。[0215] 比较DNaseI和P214A突变体在qPCR方案中的不耐热性[0216] 在存在或不存在DNaseI(1U)或P214A(1U)时，按上文所述设置反应混合物，不加模板DNA。于37℃ 10分钟的孵育步骤之后为50℃或55℃ 15分钟的失活步骤。然后，向混合物添加1pg大肠杆菌基因组DNA，并按上文所述进行qPCR。[0217] 为了解释qPCR实验中的可变反应设置-时间，在进行扩增之前，将反应混合物于室温孵育15分钟。反应混合物中的任何残余DNase活性都会降解模板DNA并会抑制qPCR结果。

[0218] 如图13所示，与对照反应(对照(-Enz)；没有添加酶)相比，P214A突变体没有抑制qPCR，所以在本实验中通过15分钟的50℃的孵育步骤，P214A突变体被认为完全失活。DNaseI酶没有失活，且Ct移动了超过8，这表明失活步骤之后的高残余活性或/和针对反应混合物中的引物/探针的活性。

[0219] 从qPCR反应混合物中去除掺入的DNA[0220] 为了测试P214A突变体去除“污染的”DNA的能力，向上述qPCR反应混合物添加各种量的P214A突变体(TaqMan Gene Expression master mix)，并掺入1pg大肠杆菌基因组DNA。然后，将反应混合物于37℃孵育10分钟，接着于60℃孵育15分钟。结果在图14中示出。可以看出，每25μl反应混合物的0.25U或更多的P214A突变体导致Ct增加超过8。这表明掺入的DNA浓度下降>250倍。[0221] 除了上文讨论的个别结果之外，应当注意的是，没有模板的对照(NTC)对于Brilliant qPCR master mix(Stratagene)和TaqMan Gene Expression Master mix(Applied Biosystems)均产生阳性结果。这说明当使用通用引物靶向于细菌或大肠杆菌DNA用于检测或诊断细菌时，qPCR混合物中污染的DNA问题。[0222] 实施例8 P214A突变体对一步RT-PCR效率的影响[0223] 用几种浓度的P214A突变体重复实施例5中所描述的实验，从而研究渐增量的酶如何影响RT-PCR反应的灵敏度。测试0至1U DNase的五种不同的浓度范围，并将结果展示在图15中。利用0.1至0.5U的DNase不会影响RT-PCR的灵敏度。利用1U的酶使Ct灵敏度下降1.5。

[0224] 实施例9 从商品化的PCR产物中去除细菌DNA污染物[0225] 已经证实(实施例7)，在商品化核酸扩增反应混合物(被称为“master mix”)中

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常存在微量的细菌DNA。在用于检测病原体的qPCR实验中，这通常是一个问题，因为这些污染物的扩增会导致假阳性，包括在没有模板的对照(NTC)中。在本实施例中，向来自四个不同供应商的qPCR master mix添加1U P214A突变的DNase，并于37℃预孵育10分钟。之后，将master mix于60℃孵育15分钟，并与实施例7中所述的qPCR反应中的未处理master mix进行比较。不向任何反应添加模板。结果展示在图16中，可以看出只有与酶预孵育的master mix产生了阴性NTC。

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