生物技术实验设计方案-- 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建

生物技术实验设计方案

题 目：棉花

MYB转录因子的克隆与载体构建 院（系）： 专业： 班级： 姓名： 学号： 成绩： 完成日期：

棉花MYB转录因子的克隆与载体构建

1、棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景和目的、意义 1.1 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景

MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。

分子结构是每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸残基，它们参与空间结构中疏水核心的形成。有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氡基酸所取代，尤其是在植物R2R3-MYB转录因子中，R3MYB结构域的第一色氨酸经常被亮氨酸、异亮氮酸或苯丙氨酸所取代。其次，在每个保守的色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的C-末端通常是一簇酸性氨基酸正是上述这些保守的氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-螺旋-转角-螺旋结构。

特点及功能是参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，苯丙烷类代谢是植物主要的3条次生代谢途径之一，它起始于苯丙氨酸，经过几个共同步骤后，分成两个主要分支途径，其中一条分支称为黄酮类代谢途径 ，主要与植物色素合成相关。R2R3-MYB转录因子作为调节蛋 白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控， 主要的证据来自对欧芹、玉米、金鱼草和矮牵牛中黄酮类分支途径的生化和遗传学研究。

MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用；对MYB转录因子基因LHY和CCA1的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控。前人研究进展MYB转录因子具有高度保守的DNA结合域——MYB结构域。在每个MYB区域中，一般都含有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18～19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角-螺旋（HTH）的构型起着非常重要的作用。此外，大多数MYB转录因子在C-端与DNA结合域之间都具有一个富含酸性氨基酸的转录激活功能域。根据所含MYB结构域的数目，植物中的MYB类转录因子可分为单一MYB结构域蛋白、两个重复MYB结构域蛋白和3个重复MYB结构域蛋白3个亚类。植物体中绝大多数MYB蛋白有两个重复MYB结构域（R2R3），推测在拟南芥中有130多个R2R3MYB基因，约占拟南芥基因组编码基因的0.2%～0.6%；玉米中至少有80个MYB基因。近年来，利用DNA微阵列、转座子标签、T-DNA激活标签及同源克隆等方法分离克隆出了大量MYB基因，对这些基因的修饰与表达，加深了人们对其生物学功能的认识。MYB蛋白家族庞大、功能复杂多样，对MYB转录因子在植物生长发育及生理代谢中的调控机理的深入研究和解析，尚有赖于大量MYB转录因子基因及相关基因的克隆和功能分析。

目前，植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米、水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。

获得的目的基因如果不能成功连接载体依然不能研究其功能，因此能否成功构建表达载体也是植物基因工程中很重要的一步。在转基因植物中最常用的是质粒载体。pBI121是一种常用的植物表达载体，具有35S启动子和报告基因GUS基因以及抗性基因，是一种良好的载体因此在植物基因工程中被广泛应用。

1.2 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究目的及意义

棉花作为世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料，提高棉纤维长度与质量

是一项尤为迫切的任务。

棉纤维是植物腺毛的一种。植物腺毛是一种存在于植物体表的一种特化的突起结构，其形态多样、类型各异、功能多样。有单细胞和多细胞之分，也有顶端分支和不分支之分，有的还具有腺体结构，可以分泌各种生物碱等。根据形态、分布以及功能等方面的差异，植物腺毛主要分为表皮毛、根毛和棉纤维3种类型。

基于植物腺毛细胞具有特殊的结构和发育模式，植物腺毛育过程已经成为研究高等植物细胞特异分化和顶端生长的重要模式。近年来对高等植物腺毛突变体的分析，研究表明：GhCPC5与其它几种转录因子一起作用控制植物表皮毛的发育。

在棉花中棉纤维的发育虽与表皮毛和根毛有一定区别，但棉纤维是从棉花胚珠外表皮细胞发育而来的单细胞无分支结构，从起源上讲，属于表皮毛中的一种。因此，对R3转录因子的克隆和载体构建为以后研究CPC5基因在棉花中的转化以及对了解棉纤维发育做基础。 2、实验研究的目标

（1）构建以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121一DDF

（2）利用克隆出的目的基因成功构建出载体，并转化大肠杆菌经菌落鉴定此目的基因成功表达 （3）为拟南芥花絮侵染分析MYB转录调控因子在棉花纤维细胞发育和拟南芥表皮毛的发育奠定基础。 3、实验研究的基本内容

（1）提取棉花RNA并进行RAN纯度检测； （2）以RNA为模板进行反转录得到cDNA； （3）利用cDNA进行基因电子克隆；

（4）对PCR产物进行胶回收获得目的片段，并进行测序验证是否是目的基因；

（5）将目的基因通过“In-Fusion® HD Cloning System”技术连接载体，将成功构建的载体转化大肠杆菌；

（6）菌落PCR鉴定

4、实验研究的技术路线和步骤 4.1 技术路线

质粒提取 ↓

BamHⅠ、HindⅢ双酶切质粒，切掉gus基因

↓

目的基因产物（已经得到） 胶回收得到线性化载体

↓ ↓

“In-Fusion® HD Cloning System”技术连接

↓

构建好的质粒载体转化大肠杆菌

↓

PCR菌落鉴定

4.2 实验研究的步骤

4.2.1 提取棉花RNA并进行RAN纯度检测

取1g左右的棉花新鲜组织加入液氮迅速研磨成均匀的粉末,转入10mL 离心管中,加入3mL预冷的RNA

-1

提取缓冲液混匀,置于冰上;每管依次加入3 Mol·L NaAc200μL ,酸酚3 mL ,氯仿:异戊醇 600μL ( 每 加一种试剂都要轻摇混合均匀),冰浴15 min;4 ℃条件下,5300rpm离心30 min ,吸上清于另一离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇混匀;4 ℃条件下,5300rpm离心20 min ,吸上清加入等体积的异丙醇混匀后置于-20℃冰箱冷冻1h以上;4 ℃ 条件下,5300rpm离心30min,去上清,用70%乙醇清洗2～3次,并转入

115mL离心管中,干燥后溶于适量DEPC水中,取1μL进行检测,其余-70℃冰箱中保存。 4.2.2以RNA为模板进行反转录得到cDNA (1)在Microtube管中配制下列混合液

Dntp Mixture(10Mm each) Oligo Dt Primer (2.5uM) Total RNA Rnase Free dH2O

1ul 1ul 5ul Up to 10 ul

(2) 在PCR仪上进行变性、退火反应 65℃ 5min 4℃

(3) 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底中。 (4) 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液

上述变性、退火后的反应液 5×PrimeScript TM Buffer Rnase Inhibitor (40U/ul)

PrimeScript TM Rtase (for 2 Step) Rnase Free Dh2O Total Volume

10ul 4ul 0.5ul 0.5ul 5ul 20ul

(5) 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应 42-50℃15-30min 95℃5min 4℃

4.2.3利用cDNA进行基因电子克隆

第一步,选择其他物种尤其是亲缘关系较近的物种某基因全长cDNA序列或EST序列为查询探针或者以该物种某基因EST为查询探针,搜索EST数据库进Blast比对,得到许多EST序列,从中寻找感兴趣的EST( 标准的选择与可预计的同源基因的同源程度有关。通常为: 同源长度≥100bp,同源性50%以上, 85%以下) 。第二步,把感兴趣的EST基于GenBank中的非冗余数据库进行Blast分析,判断其是否是已知基因的一部分,筛选出新颖的EST。第三步,将筛选出的EST在该物种的EST数据库中进行搜索,找到部分重叠的EST进行拼接,经严格聚类分析,尽量避免含有旁系同源基因,拼接后产生的序列重叠群), 相当于实验中的一部分cDNA 步移工作。第四步,以新获得的重叠群为新的查询探针,继续搜索EST数据库, 直到没有新的EST可供拼接为止。将拼接得到的序列对非冗余数据库进行搜索,以证明这是一个全新的序列。这种策略也存在一定的局限性,许多拷贝数较低的基因很难涵盖EST数据库中,这些基因只能通过分析基因组序列才能被发现。

4.2.4对PCR产物进行胶回收获得目的片段，并进行测序验证是否是目的基因； (1)将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量。• •

注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。•

(2)向胶块中加入3倍体积Buffer• PG；当琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积Buffer• PG（如凝胶重为100• mg，其体积可视为100μl，依此类推）。•

(3)50℃孵育10分钟，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，

可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。•

注意：1）在胶充分溶解后检测pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10-30μl的3M醋酸钠（pH•5.0）将pH值调到5-7。•

• • • 2）胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA 的能力较弱。

(4)（可选步骤）当回收片段<500• bp或>4• kb时，应加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀（如凝胶为100• mg，则加入100•μl异丙醇）。•

注意：当回收片段为500•bp-4•kb时，加入异丙醇不会影响回收率。•

(5)柱平衡：向已装入收集管（Collection•Tube）中的吸附柱（Spin•Column•DL）中加入200• μl•Buffer•PS，12,000•rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。•

(6)将步骤3或者步骤4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，12,000•rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。•

注意：吸附柱容积为700•μl，若样品体积大于700•μl• 可分批加入。•

(7)（可选步骤）向吸附柱中加入500•μl•Buffer•PG，12,000•rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。•

注意：如果后续实验用于直接测序、体外转录或显微注射，推荐用此步骤以除去所有凝胶。• (8)向吸附柱中加入650•μl•Buffer•PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000•rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。• 注意：如果纯化的DNA用于盐敏感的实验（例如平末端连接或直接测序），建议加入Buffer•PW静置2-5分钟再离心。•

(9)12,000•rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。• 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。• (10)将吸附柱放到一个新离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加100•μl•Buffer•EB（pH•8.5），室温放置2分钟。12,000•rpm离心2分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。•

注意：1）• 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围）。•

2）• 为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重复步骤10。• 3）• 洗脱体积不应小于50•μl，体积过少会影响回收效率。•

4）• 如果使用TE洗脱，需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。•5）回收大于10•kb的DNA片段时，Buffer•EB应在50℃水浴中预热，适当延长吸附和洗脱时间，可增加回收效率。4.2.5将目的基因通过“In-Fusion® HD Cloning System”技术连接载体，将成功构建的载体转化大肠杆菌；

4.2.6菌落PCR鉴定

用枪尖或者牙签从平板或液体中沾少量菌（多了就会影响反应了，沾上点就够了），直接加入到PCR体系中反应就行了，依靠变性温度来破裂细菌释放DNA。 5、研究进度安排

2015年1月21日2015年1月25日 选题、定题，接受任务书。 2015年1月26日2015年4月7日

在假期和毕业实习期间，根据选择的课题，查阅文献，收集整理有关资料，拟定开题报告。 2015年4月8日2015年4月14日 提交开题报告，开始做实验。 2015年4月15日2015年5月12日

进行实验，并对实验结果进行分析和对比。

2015年5月13日2015年5月19日

整理资料和实验结果，构思论文，完成论文初稿。 2015年5月20日2015年5月26日

进行论文预答辩和答辩，根据答辩情况修改论文，并完成论文终稿，排版打印