SREBP_1在1型糖尿病大鼠肾脏的表达和胰岛素的干预性研究

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SREBP-1在1型糖尿病大鼠肾脏的表达和胰岛素的干预性研究

郝 军,朱 琳,戎赞华,段惠军

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(1.河北医科大学病理学教研室,河北石家庄 050017;2.河北医科大学附属三院肌电图室,河北石家庄 050051)中国图书分类号:R-332;R322161;R329124;R58711;R977115;R97716

文献标识码:A文章编号:1001-1978(2009)01-0095-05摘要:目的 探讨1型糖尿病大鼠肾脏脂质沉积和固醇调节元件结合蛋白-1(sterolregulatoryelementbindingprotein-1,SREBP-1)的表达以及胰岛素处理的影响。方法 以Wistar大鼠建立链脲佐菌素1型糖尿病模型并随机分为正常对照组,糖尿病模型组和胰岛素处理组。喂养2wk后处死,测定肾皮质组织甘油三酯含量,油红O染色检测脂质沉积的部位;免疫组织化学、Westernblot和原位杂交检测肾脏SREBP-1表达。结果 与正常对照组相比,1型糖尿病大鼠肾脏甘油三酯含量明显升高,油红O检测示脂质沉积定位于肾近曲小管上皮细胞,肾小球内未见着色。胰岛素处理明显降低了甘油三酯含量,和糖尿病模型组相比差异有统计学意义。免疫组织化学检测SREBP-1定位于大鼠肾脏近曲小管上皮细胞胞质,糖尿病组表达量明显高于正常组和胰岛素处理组。Westernblot证实了SREBP-1蛋白前体片段和成熟片段在糖尿病组的高表达,前体片段积分光密度比值为01673?01027,成熟片段为01670?01028,分别是正常组的1186倍和1177倍;胰岛素处理后SREBP-1蛋白前体片段表达下降了5218%,成熟片段表达量下降了3019%。原位杂交结果证实SREBP-1mRNA定位于近曲小管上皮细胞胞质,糖尿病组表达明显升高,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0101);胰岛素处理后其表达明显下降。结论 1型糖尿病大鼠肾近曲小管上皮细胞SREBP-1mRNA和蛋白表达升高可能参与了肾脏脂质沉积,胰岛素处理可有效降低SREBP-1mRNA和蛋白表达。

关键词:糖尿病;脂质沉积;固醇调节元件结合蛋白-1;胰岛素

[1,2]

例如高血流灌注、生长因子末端产物

[3]

、氧化应激、糖基化

、高血糖、高胰岛素和血脂异常等。近

年来,随着研究的深入,人们发现肾脏自身脂质代谢

[4]

的异常改变在糖尿病肾病发生中也发挥着作用。固醇调节元件结合蛋白-1(sterolregulatoryelementbindingprotein-1,SREBP-1)是一种核转录因子,对脂肪酸、甘油三酯合成有重要作用。目前,SREBP-1在糖尿病肾脏中表达和脂质代谢异常之间关系的研究鲜有报道。本研究在1型糖尿病大鼠模型中检测了肾脏SREBP-1表达,以探讨糖尿病肾脏脂质代谢变化机制,并进行胰岛素对SREBP-1表达影响的初步探索。1 材料与方法

1.1 主要试剂 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和油红O购自Sigma公司。兔抗SREBP-1多克隆抗体购自SantaCruz公司,兔抗B-actin多克隆抗体购自石家庄博海生物公司。辣根酶标记羊抗兔二抗、二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。ECL增强化学发光试剂购自美国SantaCruz公司,SREBP-1原位杂交试剂盒购自天津灏洋科技有限责任公司,甘油三酯测定试剂盒购自浙江东瓯生物工程有限公司,低精蛋白锌胰岛素注射液购自江苏万邦生化医药股份有限公司。1.2 动物分组与处理 体重120~140g健康`Wistar大鼠30只,河北省实验动物中心提供。取10只大鼠作为正常对照组(N组),其余20只造模。1型糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素60mg#kg(streptozotocin,STZ,溶于011mol#L枸橼酸盐缓冲液中配制为6g#L,pH值415),对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液。48h后尾尖取

-1

血,罗氏血糖仪测定血糖,血糖\\1617mmol#L者确定为1型糖尿病模型

[6]

-1

-1

-1[5]

糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症,也是影响病人生命的主要原因之一。其发生机制的研究揭示糖尿病中肾脏出现损伤是一个多环节、多步骤的复杂过程,涉及许多方面,

收稿日期:2008-07-20,修回日期:2008-09-15基金项目:河北省科技厅资助项目(No07276170)

作者简介:郝 军(1976-),男,博士,讲师,研究方向:糖尿病肾病

的发病机制与基因治疗,Te:l0311-86265724,E-mai:lhao-jun2004@hotmai.lcom;

段惠军(1955-),男,教授,博士生导师,研究方向:肾脏病理学,通讯作者,Te:l0311-86266942;E-mai:lduanhj@hebmu.edu.cn,每周测血糖2次,不符合

标准者弃去。将模型大鼠分为糖尿病组(DM组)和胰岛素处理组(INS组),处理组每日腹腔注射胰岛

[7]

素3个单位,保持血糖处于正常水平。各组均喂养2wk后处死,取部分肾皮质组织置于40g#L

-1

多聚甲醛固定,石蜡包埋;部分皮质组织经液氮速冻后保存于冷冻冰箱,用于冰冻切片制作和提取蛋白。1.3 方法#96#

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1.3.1 肾皮质甘油三酯含量测定 肾组织块中加入20倍体积的氯仿/甲醇液,玻璃研磨器研磨后,吸

入EP管,室温振荡20min,离心吸取上清液,加入1/5体积的生理盐水,振荡数秒,低速离心,移去上层相,下层相含有脂质,使用甘油三酯测定试剂盒检测甘油三酯浓度。

1.3.2 油红O染色检测肾皮质脂质沉积 取出-80e冷冻冰箱内肾组织标本,制作冰冻切片,厚约10Lm,经40g#L多聚甲醛固定20min,放于-20e冰箱保存备用。将切片浸泡入PBS中5min,油红O染色15min,异丙醇分化液中分化数秒,蒸馏水冲净,淡苏木精染色5min,冲净后甘油明胶封片。

1.3.3 免疫组化检测SREBP-1蛋白表达 免疫组织化学检测SREBP-1蛋白表达采用二步法免疫组化检测法,以0101mol#L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。石蜡切片常规脱蜡至水;采用微波修复法进行抗原修复;将切片置于过氧化氢甲醇溶液中,室温孵育20min;滴加一抗,4e过夜;滴加试剂1(PolymerHelper),37e孵育30min;滴加试剂2(polyperoxidase-ant-imouse/rabbitIgG),37e孵育30min,每步骤间均用PBS洗3次,每次5min。用新鲜配制的DAB-H2O2液显色,苏木精复染,中性树胶封片。免疫组化结果应用IPP图文分析软件分析,每张切片取10个高倍视野,综合阳性面积和染色深度计算阳性区域的积分光密度值(IOD),以各组的均值进行比较。1.3.4 蛋白印迹(Westernblot)检测SREBP-1蛋白表达 实验所有操作均在4e下进行,取等量的肾皮质组织,加入大约5倍湿重的裂解缓冲液,用玻璃研磨器将组织块研碎,冰上裂解30min,低温高速离心(4e、12000r#min、20min),上清液即为所提取的蛋白溶液,采用考马斯亮蓝试剂法进行蛋白定量。取等量蛋白50Lg,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶

-1

电泳后电转移到PVDF膜。50g#LBSA封闭1h,加入兔抗SREBP-1多克隆抗体(稀释比例1B500)、兔抗B-actin多克隆抗体(稀释比例1B100),4e孵育过夜。洗膜后辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(稀释比例1B5000)室温孵育2h。洗膜后加ECL试剂,然后将PVDF膜放入X线片暗盒,压片、显影、定影。用美国UVP公司LabWorks415软件对条带进行定量分析,以目的条带和B-ac-tin条带积分光密度值比值作为最终结果。1.3.5 原位杂交检测SREBP-1mRNA的表达 将冰冻切片置TritonX-100打孔液中室温10min;置过-1

-1

-1

[8]

氧化氢封闭液室温20min;滴加复合消化工作液,室温3min;滴加预杂交工作液,盖上原位杂交专用盖

玻片覆盖组织37e孵育1h,揭去盖玻片以012@SSC室温洗5min@3;滴加杂交工作液37e孵育3h,以2@SSC37e洗5min@3,012@SSC37e洗5

-1

min@3,011mol#LPBS37e洗5min@3;滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37e孵育45min,011mol#L

-1

PBS洗5min@3;滴加高敏过氧

化物酶链亲和素复合物工作液,37e孵育45min,

-1

011mol#LPBS洗5min@3;DAB显色;苏木精复染、脱水、封片,光镜观察以细胞胞质呈棕黄色为阳性,不加探针作为空白对照。结果应用IPP图文分析软件分析并计算阳性区域的积分光密度值。1.4 统计学处理 所有数据用x󰀁?s表示,采用SPSS1110统计软件进行统计分析,组间比较采用多重比较的方差分析。2 结果

2.1 大鼠肾脏脂质含量测定和定位检测 腹腔注射STZ48h后,大鼠表现为多食、多饮、多尿,血糖持续>1617mmol#L,模型鼠血糖平均值为(2019

-1

?114)mmol#L,正常对照组血糖平均值为(416?017)mmol#L,与对照组相比,模型鼠血糖水平明显升高。模型组大鼠肾脏甘油三酯含量较正常组也出现了升高,经胰岛素治疗后下降,经检测差异有统计学意义(Fig1)。冰冻切片油红O染色显示脂质沉积定位于肾近曲小管上皮细胞,正常对照组大鼠肾脏未见有脂滴着色,糖尿病大鼠肾脏在小管上皮细胞内出现明显的红染脂滴,经胰岛素治疗后,大鼠血糖被控制在正常水平,肾脏未见红染脂滴颗粒(Fig2)。

-1

-1

Fig1 Thecontentoftriglycerideinkidneyofnormalcontrolgroup,DMgroupandINSgroup

N:Norma;lDM:Diabeticmellitus;INS:Insulin.normalgroup,

##

**

P<0101vs

P<0101vsDMgroup

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中的表达 SREBP-1mRNA的检测应用原位杂交技术,结果证实正常对照组大鼠肾脏内未见明显表达,

糖尿病模型大鼠肾皮质内有明显棕黄色颗粒出现,定位于肾近曲小管上皮细胞胞质,肾小球内未见着色,见Fig5。经软件分析证实正常对照组和糖尿病组间SREBP-1mRNA表达差异有统计学意义,正常组积分光密度值为31532117?4796146,糖尿病组为76506167?6096127。胰岛素处理组大鼠肾脏经检测发现SREBP-1mRNA表达出现减少,积分光密度值为40586117?7765161,差异有统计学意义(P<0101)。

Fig2 OilredOstainingofnormalcontrolgroupandDMgroup A:Normalgroup(@400);B:DMgroup(@400)

vthearrowsshowglomerules;pthearrowsshowred-stainedlipiddropletsinproximaltubules

2.2 免疫组织化学检测SREBP-1蛋白在大鼠肾脏中的表达 免疫组织化学检测发现,SREBP-1蛋白在正常大鼠和糖尿病大鼠肾脏定位于近曲小管上皮细胞胞质,胞核无着色,肾小球内未见有棕黄色颗

粒。经图像分析显示:SREBP-1蛋白在糖尿病大鼠肾脏表达明显高于正常组大鼠,软件分析阳性区域积分光密度值为80019117?5698151,是正常组大鼠的2143倍。胰岛素处理组肾脏SREBP-1蛋白的表达较糖尿病大鼠降低,阳性区域积分光密度值为36772183?6883116,减少了大约104%,差异有统计学意义(P<0101),见Fig3。

Fig3 mmunohistochemistrystainingofrenalSREBPi-1protein

innormalcontrolgroupandDMgroup

A:Normalgroup(@400);B:DMgroup(@400)

vthearrowsshowunstainedglomerules;pthearrowsshowthepos-itivestainedregions

Fig4 TheexpressionofprecursorandmaturesegmentofSREBP-1proteininkidneyofnormalcontrolgroup,DMgroupandINSgroupbyWesternblot

A:TheexpressionofprecursorandmaturesegmentofSREBP-1pro-tein;B:Thestatisticalchart.*DMgroup

*

2.3 Westernblot检测SREBP-1蛋白前体片段和成熟片段在大鼠肾脏中的表达 SREBP-1蛋白有两种形式:前体片段和成熟片段(活性形式),对其表达检测采用蛋白印迹法。结果发现糖尿病大鼠肾组织SREBP-1蛋白呈高表达,与正常组大鼠相比差异有统计学意义(P<0101)。前体片段条带积分光密度比值为01673?01027,成熟片段为01670?01028,分别是正常组的1186倍和1177倍。胰岛素处理引起SREBP-1蛋白前体片段和成熟片段在肾脏的表达明显下降,积分光密度比值分别为01184?01015和01163?01015,差异有统计学意义(P<0101),见Fig4。

2.4 原位杂交检测SREBP-1mRNA在大鼠肾脏P<0101vsnormalgroup;

##

P<0101vs

Fig5 ExpressionofSREBP-1mRNAinnormalcontrolgroupandDMgroupdetectedinsituhybridization A:Normalgroup(@400);B:DMgroup(@400)

vthearrowsshowunstainedglomerules;pthearrowsshowthepos-itivestainedproximaltubules

#98#3 讨论

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2009Jan;25(1)

SREBP-1蛋白活性成熟片段升高是否也源于mRNA水平上调,我们在大鼠肾脏冰冻切片中采用原位杂

交方法检测了SREBP-1mRNA的表达,结果显示和正常对照组相比,模型鼠肾脏中SREBP-1mRNA出现了明显升高,定位于肾小管上皮细胞胞质,在肾小球内未见有表达,这一发现和免疫组织化学检测SREBP-1蛋白的结果相同,提示肾小管上皮细胞内SREBP-1蛋白表达的升高来自于转录水平SREBP-1mRNA表达的增多。

胰岛素是1型糖尿病的治疗药物,采用腹腔注射给药方式,每天3个单位,连续2wk,维持大鼠血糖处于正常水平,结果发现SREBP-1蛋白和mRNA均较未治疗模型组有明显降低,对肾脏皮质甘油三酯的检测也发现相同的结果。这些均提示在糖尿病大鼠体内高血糖水平可能影响了肾小管上皮细胞中SREBP-1的转录和(或)翻译过程,而胰岛素对SREBP-1的表达升高有抑制作用。参考文献:

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糖尿病肾病是危害糖尿病病人生命的重要并发

症之一,有研究发现糖尿病病人和实验动物肾脏均出现有脂滴沉积,进一步证实这种脂质沉积在糖尿病肾病的发生中发挥了重要作用。SREBPs是从体外培养的人HeLa细胞核抽提物中纯化出来的,该蛋白属于螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指(bHLH-Zip)转录因子家族,其包括SREBP-1和SREBP-2,SREBP-1基因位于17号染色体,有19个外显子和18个内含子,其mRNA长度约为41bp,翻译的前体蛋白分子量为125ku,成熟片段分子量为68ku,SREBP-1可脂肪酸和甘油三酯的合成。一

[10]

些研究者发现在Zucker糖尿病肥胖大鼠SREBP-1的激活导致了骨骼肌细胞间甘油三酯的增多。糖尿病肾脏脂质沉积是否也和SREBP-1表达异常有关,目前还鲜有报道。

实验发现STZ诱导糖尿病大鼠肾脏甘油三酯含量出现了升高,采用油红O染色揭示脂滴在近曲小管上皮细胞明显增多,这和Sun等

[11]

[9]

的研究结果

相同。免疫组织化学方法结果显示SREBP-1蛋白主要定位于肾小管上皮细胞胞质,部分胞核也可见着色,肾小球内几乎未见染色,定位和脂滴油红O染色相同,提示可能肾小管上皮细胞内SREBP-1蛋白表达增多导致了其甘油三酯合成增多。有些研究发现SREBP-1a转基因小鼠型糖尿病小鼠

[12]

[11]

、Akita和OVE261

都在肾小球中出现了脂滴沉积,而

PEPCK-promoter转基因小鼠和STZ-诱导糖尿病小[13]

鼠在肾小球内有SREBP-1高表达,但却未出现明显的脂滴,这和我们的定位研究结果不同,这种差异提示动物种属、基因水平改变、高糖环境刺激可能参与了糖尿病肾脏SREBP-1的表达和脂滴形成,但有待进一步证实。

SREBP-1蛋白有两种形式,前体和成熟片段,前体蛋白在胞质内合成并结合于内质网膜上,经过两次酶切后形成小的成熟片段并进入细胞核中和DNA结合发挥转录作用。研究采用Westernblot检测了这两种形式蛋白的表达,发现在1型糖尿病大鼠肾脏皮质中二者均有明显升高。实验在糖尿病大鼠肾脏的发现和Szolkiewicz等

[14]

在肾功衰

竭模型动物中的发现相似,该研究发现SREBP-1可导致肾功衰竭肾脏中出现脂质沉积。 有学者建立小鼠肝细胞系H2-35,在高糖刺激后检测了SREBP-1成熟蛋白和mRNA表达,结果证实SREBP-1蛋白成熟片段的上调来自于SREBP-1mRNA水平的升高[15]

。为了证实糖尿病肾脏中中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2009Jan;25(1)

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ExpressionofSREBP-1inkidneyoftype1

diabeticratsandinsulinintervention

HAOJun,ZHULin,RONGZan-hua,DUANHu-ijun

1

2

1

1

(1.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050017,China;

2.DeptofElectronyography,the3rdAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050051,China)

Abstract:Aim Toinvestigatetheexpressionofulatedinrenaltubularepitheliumofdiabeticratsandinsulintreatmentsuppressedtheincreasing.There-sultsofwesternblotshowedthattheprecursorandma-turesegmentsofSREBP-1proteininkidneyofdiabetesgroupratswereabout1186timesand1177timesre-spectivelyofthatofnormalcontrolgrouprats.Insitu

hybridizationconfirmedtheincreasingofSREBP-1mRNAinrenaltubularepitheliumindiabeticrats.TheeffectofinsulintreatmentonSREBP-1expressionwasdetectedbythemethodsofWesternblotandinsituhy-bridizationanditwasfoundthattheSREBP-1mRNAandproteinofkidneyweredown-regulated.Comparedwiththenormalgroup,thedifferencehasstatisticmeaning(P<0101);theexpressiondecreasedmarked-lyaftertheinsulintreatmen.tConclusion TheaboveresultssuggeststhatalteredSREBP-1mayplayanim-portantroleinthepathogenesisofrenallipidaccumu-lationintype1diabeticratsandinsulintreatmentcansuppressthealteration.Keywords:diabetesmellitus;SREBP-1;insulin

lipidaccumulation;

SREBP-1(sterolregulatoryelementbindingprotein-1)

inthekidneyoftype1diabeticratsandtheeffectofinsulin.Methods Thetype1diabeticmodelswereinducedbyhighdoseofSTZandratswererandomlydividedintothreegroups:normalcontrolgroup,diabe-tescontrolgroupandinsulintreatedgroup.Atthe2ndweekend,thetriglyceride(TG)contentinthekidneyofexperimentalratswasmeasuredbytheassaykitandoilRedOstaining.Furthermore,theexpressionofSREBP-1proteinwasdetectedbythemethodsofWes-ternblotandimmunohistochemistry.TheanalysisofSREBP-1mRNAwasperformedbyinsituhybridiza-tion.Results Comparedwiththecontrolgroup,thetype1diabeticrats.renaltriglyceridecontentmarked-lyincreased,andtheresultofOilRedOshowedthatlipiddepositedintherenaltubularepithelium.Triglyc-eridecontentmarkedlydecreasedafterinsulintrea-tmen.tThedifferencehadstatisticmeaning,comparedwiththediabetesmodelgroup.ImmunohistochemistrypresentedtheresultsthatSREBP-1proteinwasup-reg-