重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化

作者：吴铭，郭立泉，陈光

来源：《湖北农业科学》 2014年第10期

吴 铭１，２，郭立泉１，陈 光３

（１．吉林工商学院粮油食品深加工吉林省重点实验室，长春 １３００６２；２．东北师范大学生命科学学院，长春 １３００２４；３．吉林农业大学生命科学学院，长春 １３００００）

摘要：以Ⅵ型人胶原蛋白Ａ２链基因为模板，ＰＣＲ扩增得到目的基因ＣＰ６，构建了重组胶原蛋白表达载体，然后筛选高效表达的宿主菌，检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。结果表明，重组胶原蛋白在Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中表达量相对最高，重组质粒稳定性也较高。较佳的表达条件为接种量４％或５％，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时，加入０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ，培养５ ｈ，并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２的单克隆抗体有特异性反应。

关键词：胶原蛋白多肽；大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；表达；优化

中图分类号：Ｑ８１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）10－2443-05

胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取，将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同，并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质［１］。目前，研究者已经发现了很多生物体的多肽，而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节，如神经传导、细胞增殖和生长等。因此，在胶原蛋白的研究中，胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。在胶原蛋白的众多类型中，Ⅵ型胶原蛋白（ＣⅥ）几乎分布在所有结缔组织中，而且它还具有维持组织完整性，能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激ＤＮＡ合成，具有生长因子的特性［２，３］。

目前，研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Ｂｅｔｈｌｅｍ肌病的主要原因，而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化，Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体，并将其转化到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中进行表达研究，为后续研究奠定了基础。

１ 材料与方法

１．１ 菌种

大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α由吉林农业大学生物物理实验室保存。大肠杆菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）均购自宝泰克生物有限公司。

１．２ 试剂与质粒

ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；ＰＣＲ纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Ａｘｙｇｅｎ凝胶回收试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司；小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２蛋白抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅ

ｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６－ＣｏL６Ａ２由吉林农业大学生物物理实验室自行构建；质粒ｐＥＴ３２ａ购自宝生物工程（大连）有限公司。

１．３ 方法

１．３．１ 引物的设计 根据ＧｅｎＢａｎｋ中已报道的Ｃｏｌ６Ａ２序列中的开放阅读框，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物，Ｐ１为5′-ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣ

ＣＡＡＧ-3′，Ｐ２为5′-ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＧＣＣ

ＴＣＣＴＴ-3′，分别含有ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ酶切位点，由深圳华大基因科技有限公司合成引物。

１．３．２ 重组质粒的构建与鉴定 以ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６－Ｃｏｌ６Ａ２质粒为模板，利用合成的引物，通过ＰＣＲ扩增获得目的基因ＣＰ６，ＰＣＲ扩增程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物以１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，用Ａｘｙｇｅｎ凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行回收纯化。将回收的目的基因ＣＰ６与ｐＥＴ３２ａ载体连接后转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，然后用质粒提取试剂盒提取质粒，用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ进行双酶切处理鉴定阳性克隆，并送深圳华大基因科技有限公司进行测序。

１．３．３ 高效表达宿主菌的筛选以及重组质粒不稳定性的检测 将重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６转化大肠杆菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３） ４种宿主菌中，以ｐＥＴ３２ａ空载体转化的大肠杆菌作为空白对照。将阳性菌种作为出发菌，并用２０％甘油保存该菌种作为第１代；７ ｄ后，取２００ μＬ第１代菌种接种到５ ｍＬ添加ＬＢ培养基（含１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ）中培养，并用甘油保存菌种，记为第２代，依此类推，共计１５代，通过不同传代次数对目的蛋白表达的影响来验证ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６质粒的不稳定性。

１．３．４ 重组蛋白高效表达的培养条件 从鉴定后的转化平板上挑取单菌落到５ ｍＬ ＬＢ液体培养基（含 １００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ），３７ ℃培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７，然后根据不同的ＩＰＴＧ浓度、培养条件以及诱导时间等参数，筛选最佳的培养条件和诱导条件，以空白载体的菌株作为空白对照。

１．３．５ 重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定 将纯化的重组蛋白进行ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转印至醋酸纤维素膜上，再将膜在５％的ＰＢＳ缓冲液中室温封闭２ ｈ，洗膜后加入一抗在４ ℃放置２ ｈ，洗膜后再加入二抗在４ ℃放置２ ｈ，充分漂洗后加入化学发光底物Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ检测试剂，暗室Ｘ光片暗匣曝光、显影。一抗用的是Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司的ＣＯＬ６Ａ２（１－ＹＤ１９），该抗体是小鼠抗人ＣＯＬ６Ａ２蛋白抗体，用于人类起源的ＣＯＬ６Ａ２免疫印迹检测。

２ 结果与分析

２．１ 目的基因的ＰＣＲ扩增

以ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６－ＣｏL６Ａ２质粒为模板，ＰＣＲ扩增获得目的基因ＣＰ６，以１．２％琼脂糖凝胶电泳检测。由图１可以看出，目的条带大小为７５０ ｂｐ，与预期大小相符，并将ＰＣＲ产物送深圳华大基因科技有限公司进行测序，测序结果验证正确。

２．２ 重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６的构建

将纯化的ＰＣＲ扩增产物与载体ｐＥＴ３２ａ连接后转入大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，经过菌落ＰＣＲ初步筛选，获得的含有外源片段的重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６，用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ进行双酶切处理后可得到两段片段（图２），与预期大小一致，成功获得含有目的基因片段的重组质粒。

２．３ 高效表达宿主菌的筛选

取测序正确的重组质粒分别转化大肠杆菌 ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）４种宿菌，涂布于ＬＢ（含１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ）固体培养基，随机挑取单菌落过夜培养，然后进行菌落ＰＣＲ验证，筛选阳性重组菌，对阳性重组菌进行诱导表达，并收集表达的蛋白后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，从中筛选蛋白表达量高的重组菌株。从图３可知，４号菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）的重组蛋白表达量相对最高，取其作为后期研究的重组菌，进行大量培养。

２．４ 重组质粒不稳定性检测

大肠杆菌基因工程菌中质粒稳定性问题是基因工程菌实现规模化生产的一个重要影响因素，主要原因是含有外源基因的重组质粒转化到大肠杆菌细胞后，会产生很多生理效应，从而影响到质粒自身的稳定性。因此，外源基因的表达，不仅会导致宿主细胞自身生长速率的下降，而且会导致菌体形态的改变。这些影响主要表现为重组ＤＮＡ质粒的丢失和质粒中的基因结构发生突变，能使细胞失去表达能力［５］。本试验对重组质粒ｐＥＴ３２ａ－ＣＰ６的质粒不稳定性研究主要是通过不同传代次数对目的蛋白表达的影响来验证。将不同传代次数的菌种涂布于１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ的ＬＢ平板，３７ ℃培养１～２ ｈ，分别挑出单菌落接种到５ ｍＬ 含１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ的 ＬＢ液体培养基中，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时，加入１ ｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ ｈ，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测，主要检测重组蛋白的表达量。

由图４可以看出，重组菌株表达重组蛋白的效率在不同的传代次数上几乎没有差异性。随着传代次数增加，没有出现质粒分离的不稳定性现象，表明成功构建了能稳定表达蛋白的重组表达菌株。

２．５ 重组蛋白表达培养条件和诱导条件的优化

２．５．１ 接种量对重组蛋白表达量的影响 在相同的摇瓶和相同装液量的情况下，不同的接种量会对目的蛋白的表达造成影响。接种量依次按０．５％、１％、２％、３％、４％、５％和１０％接入含１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基。３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时，加入１ ｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，然后培养６ ｈ，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组蛋白的表达量。从图５中可以看出，在相同培养条件下，当接种量为４％和５％时，重组蛋白的表达量较高。随着接种量的增加，重组蛋白的表达量呈明显的下降趋势，当接种量达为１０％时，重组蛋白表达甚微。

２．５．２ ＩＰＴＧ浓度对重组蛋白表达量的影响 ４％接种后，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时，向培养基中加入终浓度分别为０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，然后培养６ ｈ，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测重组蛋白的表达量。由图６可以看出，ＩＰＴＧ浓度对重组蛋白表达量的影响不大，考虑到ＩＰＴＧ的毒性和成本，最终确定ＩＰＴＧ浓度为０．５ ｍｏｌ／Ｌ时效果最佳。

２．５．３ ＩＰＴＧ添加时间对重组蛋白表达量的影响在５０ ｍＬ ＬＢ液体培养基，４％接种后３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培养，培养至ＯＤ６００ ｎｍ分别为０．３、０．５、０．６、０．７、０．８时，添加０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ进行诱导，然后培养６ ｈ，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测重组蛋白的表达量。从图７分析可知，ＯＤ６００ ｎｍ为０．３时重组蛋白的表达量很低，而ＯＤ６００ ｎｍ为０．５、０．６、０．７、０．８时添加ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达量差异不大，最后综合考虑选择在ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时添加ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达。

２．５．４ ＩＰＴＧ诱导时间对重组蛋白表达量的影响在ＬＢ液体培养基中，４％接种后，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培养，培养至ＯＤ６００ ｎｍ为０．７时，向培养基中加入０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ，然后分别培养３、４、５、６、７、８、９、１０ ｈ，取样进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测重组蛋白的表达量。从图８可以看出，在加入ＩＰＴＧ诱导５ ｈ时，重组蛋白的表达量最高，综合考虑，诱导５ ｈ为最佳诱导时间。

３ 小结与讨论

目前，胶原蛋白的提取主要采取传统的提取方法，利用酸、碱水解法从动物的结缔组织（如猪皮、鱼皮、驴皮、牛皮等）中提取胶原蛋白，但是提取过程中会使其丧失部分的生物活性，并且提取得到的产品成分也非常复杂［５－８］；其次就是利用酶解法提取胶原蛋白，这种方法具有较高的回收率，反应速度快，反应时间短，但是从动物组织提取的胶原蛋白多数不溶于水，并且也不可能在不改变分子质量的前提下重新溶解。因此，从动物组织提取的胶原蛋白可加工性弱，这就直接限制了胶原蛋白在许多方面的应用［２－６］。基因工程法生产的胶原蛋白具有安全性好、重现性好、结构稳定等优点，同时也能改善胶原蛋白的免疫排异性、亲水性等性能，从而解决了传统提取方法存在的很多缺点。

目前有关在原核细胞中表达胶原蛋白的相关研究不多，有许多问题尚待解决。首先，重组质粒上的胶原蛋白目的基因在宿主菌中是否稳定；其次，重组胶原蛋白在宿主菌中是否稳定，对宿主菌有多大的毒害作用。由于人工重组质粒往往表现出不稳定性［５］，因此对重组菌，特别是用于生产的重组工程菌进行重组质粒遗传稳定性的研究是十分必要的。所谓质粒不稳定性是指工程菌在生长过程中质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特征［５］。因为外源基因的插入势必会影响到质粒原有的复制和转录机制，一是插入的位点与质粒的稳定性有关；二是插入的外源基因一般表达真核细胞的蛋白。这样必然影响到宿主细胞本身基因的表达，改变宿主菌正常的生理状况，从而影响质粒的稳定性［５］。通过鉴定连续传代中不同代次重组菌菌落的氨苄青霉素抗性，可以获得质粒丢失菌的比例。结果表明，该重组菌在连续培养过程中未发现质粒丢失菌，工程菌株表达重组蛋白的效率在不同的传代次数上几乎没有差异性，而且随着传代次数的增加，并没有出现质粒分离的不稳定性现象。同时需要注意的是该重组菌在高密度发酵条件下的遗传稳定性需要进一步验证。

本研究利用基因工程的方法对人的Ⅵ型胶原蛋白多肽进行重组表达和纯化，并对胶原性多肽在原核细胞中的表达条件进行了初步探索。结果表明，接种量对重组蛋白的影响明显，当接种量过大时，就会直接影响菌体生长状态，影响重组蛋白的表达；溶氧量过小会导致菌体生长不足，从而影响重组蛋白的表达；ＩＰＴＧ的浓度对重组蛋白表达率的影响不大，综合考虑，选择接种量４％或５％，IPTG浓度为０．５ ｍｏｌ／Ｌ，ＩＰＴＧ添加时间为ＯＤ６００ ｎｍ为０．７，ＩＰＴＧ诱导时间为５ ｈ作为蛋白表达的较佳条件。原核表达体系与其他表达体系相比，大肠杆菌作为真核基因的表达宿主具有很多优点，如遗传背景清楚、技术操作简便、培养条件简单、大规模发酵成本低、繁殖快及生长周期短等［９－１３］，因此本研究选用大肠杆菌表达体系，利用基因工程法生产胶原蛋白多肽，但是目前仅是对工程菌的构建和表达做了初步的研究，后续重组蛋白的纯化和活性验证还有待深入的研究。

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（责任编辑 屠 晶）