(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111315886 A(43)申请公布日 2020.06.19
(21)申请号 201780092441.0(22)申请日 2017.06.23(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2019.12.23(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CN2017/089823 2017.06.23(87)PCT国际申请的公布数据
WO2018/232750 ZH 2018.12.27
(71)申请人 珠海亿胜生物制药有限公司
地址 519088 广东省珠海市高新区科技6路
88号(72)发明人 方海洲 戴佩旻 杨波 王新志
王振恒 严贤龙 薛琦 熊璎珞
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公
司 72001
代理人 罗文锋 黄登高(51)Int.Cl.
C12N 15/12(2006.01)C12N 15/70(2006.01)A61K 38/18(2006.01)A61P 27/02(2006.01)
(54)发明名称
重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)以及包含rh-bFGF的药物组合物(57)摘要
提供了一种重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh-bFGF）的突变核酸分子，和所述rh-bFGF的药物组合物及其用途。
CN 111315886 A卜
(19)
按照专利合作条约所公布的国际申请
世界知识产权组织
(12)
国际局
(43)
2018
(10)
年12
15/1215/70
国际公布日月27日（27.12.2018)
(2006.01)(2006.
)
A61K6
38/187/PCT/CN20
2017
(2006.01)(2006.01)17/089823
国际公布号
PCT
WO2018/232750A1
保护）：ARIPO
(51)国际专利分类号：
C12NC12N(21)(22)
(84)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的地区
(BW,
GH,GM,KE,LR,LS,MW,
MZ
NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,
欧亚（AM，
国际申请号国际申请日
年
6
欧洲(AL,
AT,BE,BG
CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU
月
23
日(23.06.2017)
中文中文
MT,NL,NO,PL,PT
(25)申请语言：(26)公布语言:
(71)
RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,CLCM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG)。
申请人：珠海亿胜生物制药有限公
司（ZHUHAIESSEXBIO-PHARMACEUTICALCO.,LTD.)[CN/CN]；中国广东省珠海市高新区科技6路88号，Guangdong519088(CN)„发明人：方海洲(FANG,Haizhou)；中国广东省珠海市高新区科技6路88号，Guangdong519088(CN。曲伟(QU,Wei);中国广东省珠海市高新区科技6路88号，Guangdong519088(CN)。戴佩旻(DAI,Peimin)；中国广东省珠海市高新区科技6路88号，Guangdong519088(CN)。杨波(YANG,Bo);中国广东省珠海市高新区科技6路
王新志(WANG,88号，Guangdong519088(CN)„
Xinzhi);中国广东省珠海市高新区科技6路
王振恒(WANG,88号，Guangdong519088(CN)„
Zhenheng);中国广东省珠海市高新区科技6路88号，Guangdong519088(CN)。
本国际公布：
-包括国际检索报告(条约第21条(3))。-包括说明书序列表部分(细则5.2(a))。
(72)
(74)
代理人：中国专利代理
（香港）有限公司
(CHINAPATENTAGENT(HK)LTD.)；中国香港特别行政区香港湾仔港湾道23号鹰君中心22字楼，HongKong(CN)„保护）：AE,
(81)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的国家
AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,
BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,ML,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,
<
SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW。
(54)Title:RECOMBINANT
COMPRISING
HUMAN-BASICRH-BFGF
FIBROBLASTGROWTHFACTOR(RH-BFGF)ANDPHARMACEUTICAL
COMPOSITION
(54)发明名称：重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)
(57)Abstract:pharmaceutical(57)
Provided
areamutantnucleicoftherh-bFGF,
acidmolecule
composition
andausethereof.
以及包含rh-bFGF的药物组合物
fibroblast
growth
factor(rh-bFGF),
a
ofarecombinanthuman-basic
摘要：提供了一种重组人碱性成纤维细胞生长因子和所述rh-bFGF的药物组合物及其用途。
（rh-bFGF)的突变核酸分子，
重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)以及包含rh-bFGF药物組合物
技术领域
的
本发明涉及DNA重组和生物制药领域。更具体地，本发明涉及编码重组人碱性成纤維细胞生长因子(recombinant
human-basic
fibroblast
growthfactor,rh-bFGF)的突变核酸分子、包含所述rh-bFGF的药物组合
物以及所述药物组合物用于治疗干眼症的用途。
背景技术
干眼症是指任何原因造成的泪液质量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和/或眼表组织病变的多种疾病的总称又称角结膜干燥症。
当泪膜液性泪液产生减少，粘液分泌异常，和睑板腺功能障碍等各种原因，引起泪膜各成分的绝对和相对缺乏，眼表泪液分布异常，泪液蒸发增加时，可以引起干眼症。
常见的症状包括眼睛干涩、容易疲倦、眼痒、有异物感、痛灼热感、分泌物黏稠、怕风、畏光、对外界刺激很敏感；有时眼睛太干，基本泪液不足，反而刺激反射性泪液分泌，而造成常常流泪；较严重者眼睛会红肿、充血、角质化、角膜上皮破皮而有丝状物黏附，这种损伤日久则可造成角结膜病变，并会影响视力。
如今干眼症患者日益增多，目前市售产品例如玻璃酸钠滴眼液、聚乙烯醇滴眼液、聚乙二醇滴眼液等能緩解干眼症状，但仅能起人工泪液的作用。天然泪液成分复杂，且天然泪膜三层结构的完整性是实施其有效功能的基础，人工泪液不能完全替代。
另外，目前市售产品中含有防腐剂，长期使用含防腐剂的药物会对眼表造成损害并且可能导致眼表疾病加重。
目前没有将bFGF用于治疗干眼症的产品，并且目前没有报道将人源的bFGF用于干眼症的治疗。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种编码重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子。
在一个方面，本发明提供一种由所述突变核酸分子编码的重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)
。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤維细胞生长(rh-bFGF)和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤維细胞生长(rh-bFGF)和至少一种选自甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)的稳定剂。
在一个方面，所述药物组合物不含防腐剂。
在一个方面，本发明提供一种治疗干眼症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的所述药物组合物。
附图说明图1为pET-30a
(+)
质粒结构图。
图2为rh-bFGF的WesternBlot结果。
图3显示了通过高效液相色谱而检测的rh-bFGF纯度。图4显示了rh-bFGF完整蛋白的分子量质谱图。
图5显示了天然人bFGF的cDNA序列、氨基酸序列以及经突变的人bFGF氨基酸序列。
图6显示了rh-bFGF体外活性检测的四参数拟合曲线，其中C为EC50值。
图7显示了在热压力条件下，不同氨基酸，包括组氨酸、甘氨酸和精氨酸以及吐温对rh-bFGF
纯度变化的影响，其中95%LINE
指
rh-bFGF原液的纯度质量标准；原液纯度低于95%则表示纯度不合格。
图8显示了在热压力条件下，HSA对rh-bFGF纯度变化的影响。图9显示了不同浓度的rh-bFGF
滴眼液对碱烧伤新西兰兔干眼症
模型泪液分泌的影响。符号\"*\"或\"**\"表示显著差异(p<0.05或p<0.01)。
图10显示了不同浓度的rh-bFGF滴眼液对碱烧伤新西兰兔干眼症模型泪膜破裂时间的影响。符号\"*\"p<0.01)。
发明详述
在一个方面，本申请发明人首次开发了一种包含重组人碱性成纤維细胞生长因子和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤維细胞生长因子；rh-bFGF)和至少一种选自甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)的稳定剂。在这一方面，预料不到地发现，所述重组人碱性成纤維细胞生长因子与所述稳定剂构成了特定的稳定性组合。
在一个方面，所述药物组合物不含防腐剂。
在一个方面，本发明提供一种编码重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子。在一个方面，本发明提供一种编码重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子，其包含选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的序列，或与SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3具有至少95%、96%、97%、98或99%同一性的序列。在一个方面，本发明提供一种编码重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子，其为选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的序列。
在一个方面，本发明提供一种由所述突变核酸分子编码的重组人碱性成纤維细胞生长因子(rh-bFGF)。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤維细胞生长(rh-bFGF)和至少一种药学上可接受的赋形剂。在一个方面，所述赋形剂包括，但不限于，緩冲体系、增稠剂、稳定剂、中和试剂、保湿剂等。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤維细胞生长(rh-bFGF)和至少一种选自甘氨酸、组氨酸、精氨酸、
或
表示显著差异(p<0.05或
吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)的稳定剂。
在一个方面，所述赋形剂包括緩冲体系。所述緩冲体系包括，但不限于，磷酸二氫钠-磷酸氫二钠、枸橼酸-磷酸氫二钠或硼酸-硼砂。在一个方面，所述緩冲体系为麟酸二氫钠-麟酸氫二钠。在一个方面，所述緩冲体系为枸橼酸-磷酸氫二钠。
在一个方面，当磷酸二氫钠和磷酸氫二钠作为緩冲体系时，磷酸二氫钠、磷酸氫二钠分別以
1.25mg/mL-3.75mg/mL
0.25mg/mL-1.25mg/mL
、
的浓度存在。
在一个方面，当磷酸二氫钠和磷酸氫二钠作为緩冲体系时，磷酸二氫钠、磷酸氫二钠分別以0.2-2.5mg/mL0.5-5.0mg/mL的浓度存在。
在一个方面，当磷酸二氫钠和磷酸氫二钠作为緩冲体系时，磷酸二氫钠、磷酸氫二钠分別以0.425mg/mL
、2.50mg/mL
的浓度存在。
在一个方面，所述赋形剂包括增稠剂。所述增稠剂包括，但不限于，聚乙烯醇，透明质酸钠、甲基纤維素、羟甲基纤維素、羟乙基纤維素、羟丙甲纤維素、泊洛沙姆或卡波姆的增稠剂。在一个方面，所述增稠剂为聚乙烯醇。在一个方面，所述增稠剂为卡波姆。在一个方面，所述卡波姆例如卡波姆940、卡波姆934、卡波姆974、卡波姆980等系列，优选卡波姆980系列。
在一个方面，所述增稠剂通常以0.1-20.0mg/mL
的浓度存在。在一
6.0mg/mL
12.0
个方面，所述增稠剂通常以5.0-15.0mg/mL,例如5.0mg/mL
7.0mg/mLmg/mL
8.0mg/mL13.0mg/mL
9.0mg/mL14.0mg/mL
10.0
g/mL
11.0mg/mL
的浓度存在。
在一个方面，当聚乙烯醇作为增稠剂时，组合物中聚乙烯醇的量通常为5.0mg/mL
10.0mg/mL。
、6.0mg/mL
7.0mg/mL8.0mg/mL9.0mg/mL
在一个方面，当卡波姆作为增稠剂时，组合物中卡波姆的量通常为5.0mg/mL
mg/mL。
、6.0mg/mL
7.0mg/mL8.0mg/mL9.0mg/mL10.0
在一个方面，所述赋形剂包括稳定剂。所述稳定剂包括，但不限于，肝素钠、人血白蛋白(HSA)、甘氨酸、组氨酸、精氨酸，吐温(Tween)或其两种或更多种的组合。在一个方面，所述稳定剂为肝素钠和人血白蛋白(HSA)。在一个方面，所述稳定剂为人血白蛋白(HSA)。在一个方面，所述稳定剂为甘氨酸。在一个方面，所述稳定剂为组氨酸。在一个方面，所述稳定剂为精氨酸。在一个方面，所述稳定剂为吐温，例如吐温-20。
在一个方面，当肝素钠和人血白蛋白作为稳定剂时，组合物中肝素钠的量通常为0.1-100g/mL、25.0-75.03060
g/g/
L、35L、70
g/g/
g/
L,例如0.25-75.0
gmL、15
g/
g/
g/L、20
g/
L,例如0.25-5.0g/mL、25g/L、55
g/
L、
g/mL,例如10L、40
g/
L、45L、50L、
L、或75g/mL;组合物中人血白蛋白的量通常为
0.025-0.375mg/mL0.2mg/mL
0.1-0.375
0.01-10.0mg/mL,mg/mL,
例如0.03-10.0mg/mL
0.15mg/mL
例如0.1mg/mL0.25mg/mL或
0.3mg/mL„
在一个方面，当人血白蛋白作为稳定剂时，组合物中人血白蛋白的量通常为0.01-10.0mg/mL,
例如0.03-10.0mg/mL。
在一个方面，当甘氨酸、组氨酸、精氨酸作为稳定剂时，组合物中甘氨酸、组氨酸、精氨酸的量通常为2%-5%4%或5%。
在一个方面，所述赋形剂包括中和试剂。所述中和试剂包括，但
(w/v)，例如2%、3%、
不限于，三乙醇胺、氫氣化钠、氫氣化钾、碳酸钠、碳酸氫钠、碳酸氫
钾或硼砂。在一个方面，所述中和试剂为三乙醇胺。
在一个方面，所述中和试剂通常以1.25-12.5mg/mL,例如5mg/mL6mg/mL
7mg/mL
8mg/mL
9mg/mL或10mg/mL的浓度存在。
在一个方面，当三乙醇胺作为中和试剂时，组合物中三乙醇胺的量通常为5-12.5mg/mL,例如5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL„
在一个方面，所述赋形剂包括保湿剂。所述保湿剂包括，但不限于，甘油、丙二醇或其混合物。
在一个方面，所述保湿剂通常以0.1-50.0
mg/mL的浓度存在。在
一个方面，当甘油作为保湿剂时，组合物中甘油的量通常为12.5-50.0mg/mL,
列唢口12.5-25.0mg/mL
、
25.0-50.0mg/mL,列唢口25.0mg/mL
。
在一个方面，将组合物緩冲至约6.0-8.0的H,例如6.0、6.1、
6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH或其间的任何范围限定的pH。
在一个方面，本发明提供一种治疗干眼症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的所述药物组合物。
在一个方面，本发明提供用于治疗干眼症的所述药物组合物。在一个方面，本发明提供所述药物组合物用于治疗干眼症的用途。在一个方面，本发明还提供所述组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的用途。
在一个方面，本发明的药物组合物可通过多种给药途径施用，例如向有需要的患者经眼给药，例如通过结膜给药。
本发明的药物组合物可以多种剂型给予，例如作为溶液剂、混悬
剂、乳剂、微乳剂、复合型轧剂、滴剂、凝胶、喷雾剂、滴眼剂、眼用软膏剂、眼用洗剂和注射液。
在一个方面，本发明的药物组合物为眼用药物组合物。特别地，本发明的药物组合物为滴眼液或凝胶的形式。
本发明所述的药物组合物的优点在于，所述rh-bFGF
与所述稳定
剂例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)预料不到地构成了特定的稳定性组合。特別地，甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)明显改善rh-bFGF
的稳定性。此外，
与非人来源的bFGF相比，本发明人源化的bFGF在免疫学上具有更高安全性。
参考以下的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1.核酸突变
在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，将编码天然人bFGF的cDNA序列（SEQIDNO:4)进行突变，设计并合成了3种突变的cDNA序列（分别为如SEQIDNO:l、SEQIDNO:和SEQIDNO:3所示的突变的cDNA序列1、序列2和序列3):
突变的cDNA序列1(SEQIDΝΟ:1)
atggetgetggttcgattacgacgctgccggetctgccggaagatggtggtteaggtgcatttccgccgggtcactttaaggatccgaaacgtctgtattgcaagaacggcggctttttcctgcgcattcatccggatggccgtgtcgacggtgtgcgcgaaaaaagegatccgcacattaagctgcagctgcaagcagaagaacgtggcgtggttageateaaaggtgtttgtgcgaaccgttacctggccatgaaagaagatggccgcctgctggetagtaagtgcgtcaccgacgaatgctttttctttgaacgtctggaatecaacaattataatacctaccgtagecgcaaatatacgtcttggtatgtggccctgaaacgcacgggccagtataagctgggttecaaaacgggtccgggtcaaaaagccattctgttcctgccgatgtecgcaaaateataa
突变的cDNA序列2(SEQIDNO:2)
atggetgetggttctateaccaccctgccggetctgccggaagacggtggttctggtgetttcccgccgggtcacttcaaagacccgaaacgtctgtactgcaaaaacggtggtttcttcctgcgtatecacccggacggtcgtgttgacggtgttcgtgaaaaatctgacccgcacateaaactgcagctgcaggetgaagaacgtggtgttgtttctateaaaggtgtttgcgetaaccgttacctggetatgaaagaagacggtcgtctgctggettctaaatgcgttaccgacgaatgcttcttcttcgaacgtctggaatctaacaactacaacacctaccgttctcgtaaatacacctcttggtacgttgetctgaaacgtaccggtcagtacaaactgggttctaaa
accggtccgggtcagaaagetatectgttcctgccgatgtctgetaaatcttaa
突变的cDNA序列3(SEQIDNO:3)
atggcagccggtageateaccaccctgccggccctgccggaggatggcggcageggcgccttcccgccgggccacttcaaggacccgaagcgtctgtactgcaaaaacggtggcttcttcctgcgcatecacccg
gacggccgtgttgacggtgtccgtgagaagagegaccctcacateaagctgcaactgcaagcagaa
gagcgtggtgttgtgtctateaaaggtgtgtgtgetaaccgttacctggetatgaaggaagatggtcgtctgctggettctaaatgtgttaccgatgagtgtttcttttttgaacgtctggaatctaacaactacaacacttaccgttctcgtaaatacacctcttggtatgtggcactgaaacgtactggtcagtataaactgggtteca
aaaccggtcctggtcagaaagetatectgtttctgccaatgtctgetaagagetaa
实施例2.原核表达以及蛋白质表征
2.1表达和纯化
所用的表达载体为pET-30a(+)
(参见图1),购自MerkKgsA公司
(Cat.No.69909-3),该载体带有T7启动子、T7转录起始位点、HisTag、编码序列、STag编码序列、多克隆位点(Multiple
cloningsites,MCS)、
T7终止子、乳糖编码序列、kan抗性编码序列和pBR322复制子和fl复制子。该MCS包含酶切位点XhoII
、
、
NotI
、
、
EagI
、
、
HindllL
、
Sal
、
SacI
、
EcoRI
。
、
BamHI
、
EcoRVNcoIKpnIBglII
NsVNdeI
为了克隆方便，在序列1(SEQIDNO:l)的起始密码子上游设计了NdeI酶切位点，在终止子附近设计了Hindlll酶切位点。釆用化学方法全基因合成该480bps序列，将此序列经NdeI和Hindlll双酶切后插入到经相同双酶切的表达载体pET-30a(+)上，得到了5724bps的重组质粒，经热激转化DH5a(TaKaRa,
9057),
在含有5(^g/mL
卡那
霉素的LB培养基中培养。挑选单克隆，然后经NdeI和Hindlll双酶切筛选正确的转化子。转化子的正确性通过测序再
在另一个实例中，可以使用pET-28a(+),等代替上述pET-30a(+)载体。
将含有所述蛋白序列的原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过调节菌体培养温度、诱导温度、pH范围、葡萄糖浓度与诱导剂浓度，诱导表达可溶性人bFGF。通过中空纤维洗滤收集菌体；釆用高压匀浆并保持低温而破碎发酵菌体，加入适量非离子表面活性剂后，低温高速离心收集上清液，弃去沉淀。
釆用弱阳离子交换、肝素亲和层析等方法纯化，在纯化过程中加入适量保护剂，如巯基乙醇，DTT等。
样品经过上述步骤纯化后，纯度达到95%以上。经实验证实，每100g菌体可制备重组人bFGF蛋白约600mg,
2.2纯度和分子量检测以及测序15%SDS-PAGE
电泳显示，所得的人bFGF蛋白为约18.5KD的
实现显著高效表达。
验证。
pET-23c(+)或pET-15b
单一条带(参见图2)。高效液相色谱法C8反相柱检测结果显示，本发明所得人bFGF的纯度大于95%(参见图3)。
釆用\"超高分辨、超高准确、超高灵敏\"Exactive
PlusEMR进行
精确分子量测定，4批rh-bFGF原液共检出6个组分；组分1、4、5比例基本>10%,表1),组分4为主要成分，分子量平均值为17121.02Da,批间RSD
/
0.0007,
。
与理论值的偏差≤4
口,
相对比例（以峰强度
计算)为70.7%-79.0%
表1:HPLC-ExactivePlusEMR质讲检测送检样本精确分子量
另外，重组制备的人bFGF蛋白经氨基酸序列分析，结果证实其氨基酸序列与天然人bFGF的氨基酸序列一致(参见图5)。
2.3生物学活性测定使用balb/c3T3
细胞对样品进行体外活性检测。用MTT
法判断细
胞增殖情况。结果表明所得人bFGF对balb/c3T3与bFGF活性标准品(NISCB)—致(参见图6)。
细胞的促进增殖作用
实施例3.药物组合物的制备药物组合物1:
重组人碱性成纤维细胞生长因子
2500-10000
IU;
入血白蛋白增稠剂氯化钠肝素钠
石舞酸二
0.025-0.375mg/mL;
5.0-15.0mg/mL;5.0-12.5mg/mL;0.25-5.0
g/
L;
氩))
0.25-1.25mg/mL;1.25-3.75mg/mL
。
石舞酸氩二
1、所述緩冲体系可以是上述磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，也可以
是硼酸-硼砂緩冲体系，枸橼酸-磷酸氢二钠緩冲体系等。优选药物组合物的pH值为6.5-7.5
。
2、所述增稠剂为聚乙烯醇，透明质酸钠、羟丙曱纤维素、泊洛
沙姆等，优选聚乙烯醇。
3、制备方法：
(1)将聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，于121C高压灭菌30min,
冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子、人血白蛋白、肝素钠、氯
化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无
菌注射用水定容，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
药物组合物2:
重组人碱性成纤维细胞生长因子
人血
2500-10000IU;
白蛋白0.1-0.375mg/mL;25.0-75.0
g/
L;
肝素钠卡波姆中和试剂甘油
1.25-12.5mg/mL;1.25-12.5mg/mL;12.5-50mg/mL
。
1、所述卡波姆为卡波姆940、卡波姆934、卡波姆974、卡波姆980等系列，优选卡波姆980系列；
2、所述中和试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、硼砂及三
乙醇胺，优选三乙醇胺。
3、制备方法：
(1)将卡波姆分散于适量的注射用水中，搅拌均匀后过夜溶胀，备
用；
(2)在卡波姆分散液中加入三乙醇胺，搅拌成透明均匀凝胶基质，
于121°C高压灭菌30min,灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入甘油、人血白蛋白、肝素钠、重组
人碱性成纤维细胞生长因子，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22µ
m滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，然后定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g,
即得成品。
药物组合物3:
重组人碱性成纤维细胞生长因子
人血白蛋白
1000-9000IU0.01-5.0mg/mL;0.1-20.0mg/mL;
增稠剂
氯化钠保湿剂
1.0-5.0mg/mL;0.1-50.0mg/mL
。
1、所述緩冲盐体系可以是上述磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，也可
以是硼酸-硼砂緩冲体系，枸橼酸-磷酸氢二钠緩冲体系等，优选所述
pH值为6.5-7.5
。
2、所述增稠剂为聚乙烯醇，透明质酸钠、羟丙曱纤维素、泊洛
沙姆等，优选聚乙烯醇。所述保湿剂为甘油、丙二醇或其混合物。
3、制备方法：
(1)将增稠剂、氯化钠、分散溶解于适量的注射用水中，于121C
高压灭菌30min;
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子、人血白蛋白、保湿剂、磷
酸二氢钠、磷酸氢二钠溶解于适量的注射用水中；
(3)将步骤(2)药液经过0.22µ
微孔滤膜过滤后与步骤(1)所得药
液混合，并用注射用水定容至lmL;
(4)灌装步骤(3)所得药液至不含抑菌剂的包装容器中，容器的容
积范围为0.4g/支，即得到成品。
此外，还制备了以下药物组合物(参见表2)。其中，制备滴眼液均为100ml,
制备外用凝胶均为100g
。
表2:制备实施例1-10的药物组合物制备实施例1:
(1)将l.Og聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，
冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU25mg
、人血白蛋白
肝素钠2.5mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二
钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无
菌注射用水定容至lOOmL,即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例2:
(1)将0.5g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，
冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU
、人血白蛋白
20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二
钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无
菌注射用水定容至lOOmL,即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例3:
(1)将l.Og聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，
冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU
、人血白蛋白
20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二
钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至lOOmL,
即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例4:
(1)将1.5g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU、人血白蛋白10mg、肝素钠1.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至lOOmL,
即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例5:
(1)将l.Og聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU、人血白蛋白20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、枸橼酸370.6mg、磷酸氢二钠5.9g溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至lOOmL,
即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例6:
(1)将l.Og聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，
冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU25mg
、人血白蛋白
肝素钠2.5mg、氯化钠800mg、枸橼酸370.6mg、磷酸氢二钠
5.9g溶解于适量的注射用水中，用0.22µηι滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无
菌注射用水定容至lOOmL,即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL,
即得成品。
制备实施例7:
(1)称取0.80g卡波姆940分散于适量的室温的注射用水中,搅拌60-120min,
过夜溶胀，备用；
搅拌使成透明均灭菌完成后放冷至
(2)在卡波姆940分散液中加入三乙醇胺0.60g,
匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌（121°C,30min),室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子450000IU,
搅拌均匀
后，在无菌条件下通过0.22µ并定量，搅拌均匀。
滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g,
即得成品。
制备实施例8:
(1)称取0.60g卡波姆940分散于适量的室温的注射用水中,搅拌60-120min,
过夜溶胀，备用；
搅拌使成透明均灭菌完成后放冷至
(2)在卡波姆940分散液中加入三乙醇胺0.50g,
匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌（121°C,30min),室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU,
搅拌均匀
后，在无菌条件下通过0.22µ并定量，搅拌均匀。
滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g,
即得成品。
制备实施例9:
(1)称取0.60g卡波姆974分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min,
过夜溶胀，备用；
搅拌使成透明均灭菌完成后放冷至
(2)在卡波姆974分散液中加入三乙醇胺0.50g,
匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌（121°C,30min),室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子450000IU,
搅拌均匀
后，在无菌条件下通过0.22µ并定量，搅拌均匀。
滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g,
即得成品。
制备实施例10:
(1)称取0.50g卡波姆974分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min,
过夜溶胀，备用；
搅拌使成透明均灭菌完成后放冷至
(2)在卡波姆974分散液中加入三乙醇胺0.50g,
匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌（121°C,30min),室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、20.0mg人血白蛋白、5.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU,
搅拌均匀
后，在无菌条件下通过0.22µ并定量，搅拌均匀。
滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g,
即得成品。
实施例4.稳定性研究
1)
酸对rh-bFGF
由于rh-bFGF
原液稳定性的影响研究
原液本身性质不稳定，在室温下易发生聚合沉淀。
因此选用不同的稳定剂对原液的稳定性进行初筛。选用5%与2%的甘露醇、5%与2%的甘氨酸以及2%葡聚糖，在25°C环境下放置17天。分别在第0、7与17天检测蛋白浓度，结果见表3。
表3:rh-bFGF原液稳定剂筛选试验的蛋白浓度变化率
结果表明5%甘氨酸可有效避免蛋白形成沉淀。蛋白在热破坏条件下放置17天仍可保持86.26%的蛋白。17天后，甘氨酸的效果显著优于甘露醇和葡聚糖，并且不加稳定剂的蛋白仅剩13.6%
2)组氨酸对rh-bFGF
。
原液稳定性的影响研究
进一步选用不同氨基酸(甘氨酸、组氨酸、精氨酸)和吐温20对原液的稳定性进行进一步的筛选，在25°C环境下放置18h,结果见图7。
结果表明与浓度为5%的甘氨酸相比，3%的组氨酸和0.03%的吐温20对于rh-bFGF
原液的稳定性效果更好。蛋白在热破坏条件下放
的保
置18h天纯度仍可保持85%以上。组氨酸和吐温20对rh-bFGF护作用优于甘氨酸。
3)HSA对rh-bFGF
原液稳定性的影响研究
由于HSA对蛋白含量测定有干扰，将含或不含HSA的原液在
°C
环境下放置18h,使用高分辨率色语检测经热破坏蛋白的纯度变化。结果显示在图8。
结果表明HSA能明显改善rh-bFGF
的稳定性。以95%纯度变化
率作为指标，不含HSA的样品，在压力条件下仅能维持4h,加入HSA后，可延长至15小时。证明对于bFGF,
实施例5.动物干眼模型药效研究
本研究选用新西兰兔干目艮模型，观察模型的临床指标(泪液分泌、泪膜破裂时间），评价药物的干眼临床治疗效果。将新西兰兔分成阴性对照组(Negativecontrol,
未经处理）、模型对照组(Model,
经碱烧伤处
HSA为优秀的蛋白保护剂。
理但未加入任何滴眼液)、玻璃酸钠滴眼液处理组(HAgroup),以及才艮据所用的制备实施例3的rh-bFGFg/mL)、E(8.0
g/mL)、F(16.0
g/
滴眼液浓度而分成的组D(4.0L)、G(32.0
g/L)。阴性对照组
每组72只，其余组别每组8只，剂量300µ1/眼/天。
(1)泪液分泌量(双眼)测定方法(酚红棉线湿润长度)：
釆用SchirmerI实险(SchirmerItest)测量新西兰兔泪液的分泌。即，用眼科镊夹住酚红棉线，置于新西兰兔外眦部，60s后取出测量酚红棉线湿润的长度。酚红棉线湿润后变为红色，根据湿润长度判定眼睛湿润情况。实验结果显示在图9中。
如图9所示，与阴性对照眼相比，模型对照组的酚红棉线湿润长度均显著下降。与模型对照组相比，给药第10天，rh-bFGF滴眼液DE、F、G组酚红棉线湿润长度均显著变长，具有显著统计学差异。
(2)泪膜破裂时间(双眼)测定方法：
使用可调移液器在新西兰兔眼下睑结膜嚢内滴入2µ1的0.5%荧光素钠溶液，以恒定力手动眨眼数次后，以恒定力撑开兔眼，用裂隙灯显微镜，钴蓝光观察角膜，当角膜绿色薄膜出现黑区时，表示泪膜破裂。连续测3次，取其平均值。泪膜破裂时间小于10秒，表明泪膜不稳定，是泪液中粘蛋白缺乏所致的KCS的突出标志，提示结膜的杯状细胞严重损害或丧失，容易造成干眼症。实验结果显示在图10中。
、
如图10所示，与阴性对照眼相比，给药第10天，模型对组泪膜破裂时间均显著短于阴性对照眼。与模型对照组相比，给药第10天，rh-bFGF滴眼液组D、E、F、G组泪膜破裂时间均显著延长,具有显著统计学差异。
综上，酚红棉线泪液分泌测试结果表明本发明的滴眼液能改善造模动物的泪液分泌量(见图9);泪膜破裂时间测试显示对干目艮模型的泪膜破裂时间有明显的改善作用（见图10)。rh-bFGF
滴眼液随着剂量的
升高，对碱烧伤新西兰兔干眼症模型有明显的改善作用。
虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。
权利要求书
一种编码重组人碱性成纤維细胞生长因子的突变核酸分子，其包含
1.
选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的序列，或与SEQIDNO:l、SEQIDNO:或SEQIDNO:3具有至少95%、96%、97%、98或99%同一性的序列。
2.权利要求1的突变核酸分子，其序列如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2
或SEQIDNO:3所示。
3.一种重组人碱性成纤維细胞生长因子，其由权利要求1或2的突变
核酸分子编码。
4.一种药物组合物，其包含权利要求3的人碱性成纤維细胞生长因子和至少一种药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括至少一种选自甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温、肝素钠或人血白蛋白(HSA)的稳定剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述稳定剂为甘氨酸。6.权利要求4的药物组合物，其中所述稳定剂为组氨酸。
7.权利要求4-6的药物组合物，其中所述赋形剂还包括选自磷酸二氫钠
-磷酸氫二钠、枸橼酸-磷酸氫二钠或硼酸-硼砂的緩冲体系。
8.权利要求4-7的药物组合物，其中所述赋形剂还包括选选自聚乙烯醇
透明质酸钠、甲基纤維素、羟甲基纤維素、羟乙基纤維素、羟丙甲纤維素、泊洛沙姆或卡波姆的增稠剂。
9.权利要求4-8中任一项的药物组合物，其中所述赋形剂还包括选自三
乙醇胺、氫氣化钠、氫氣化钾、碳酸钠、碳酸氫钠、碳酸氫钾或硼砂的中和试剂。
10.权利要求4-9中任一项的药物组合物，其中所述赋形剂还包括选自
甘油、丙二醇或其混合物的保湿剂。
11.权利要求4-10中任一项的药物组合物，将其緩冲至6.0-8.0的pH。
12.权利要求4-11中任一项的药物组合物，所述组合物为眼用组合物，
优选为滴眼液或凝胶的形式。
13.权利要求4的药物组合物，其包含
重组人碱性成纤维细胞生长因子
入血白蛋白
2500-10000IU;0.025-0.375mg/mL;5.0-15.0mg/mL;5.0-12.5mg/mL;0.25-5.0
g/
L;
增稠剂氯化钠肝素钠
石舞酸二氩石舞酸氢二
)0.25-1.25mg/mL;1.25-3.75mg/mL。
14.权利要求4的药物组合物，其包含
重组人碱性成纤维细胞生长因子
入血白蛋白
2500-10000IU;0.1-0.375mg/mL;
肝素钠卡波姆中和试剂甘油
15.权利要求4的药物組合物，其包含：
25.0-75.0g/mL;
1.25-12.5mg/mL;1.25-12.5mg/mL;12.5-50mg/mL。
重组人碱性成纤维细胞生长因子
人血白蛋白
1000-9000IU0.01-5.0mg/mL;0.1-20.0mg/mL;0.2-2.5mg/mL;0.5-5.0mg/mL;1.0-5.0mg/mL;0.1-50.0mg/mL。
增稠剂磷酸二氢钠石舞酸氢二钠氯化钠保湿剂
16.一种治疗干眼症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有
效量的权利要求4-15中任一项的药物组合物。
17.一种用于制备权利要求4-15中任一项的药物组合物的方法，其包括
将所述人碱性成纤維细胞生长因子与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。
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InternationalapplicationNo.
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A.
CLASSIFICATION
OFSUBJECT
MATTER
38/18(2006.01)i;A6IP27/02(2006.01)i
andIPC
C12N15/12(2006.01)i;C12N15/70(2006.01)i;A61K
AccordingB.
toInternational
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(IPC)ortobothnationalclassification
FIELDS
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C12N,A61K,A61P
symbols)
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CNKI,
DWPI,
SIPOABS,
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USTXT,
EPTXT,PATENT;
ISI
bases:
EMBL+GenBank+ddbjKeywords:
,NATIONALBIO-SEQUENCEDATABASEOFCHINESE
重组人碱性成纤维细胞生长因子，大肠杆菌，表达，稳定剂，甘氨酸，组氨酸，缓冲液，缓冲体系，增稠剂，中和剂,
humanbasic
fibroblast
growth
factor,rh-bFGF,
dryeye,stabilizer,
moisturizer,
eye
保湿齐,滴目艮液,凝胶,干目艮症,recombinant,
drops,neutralize!,e.coli,searchforSEQIDNO:1-6C.
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YY
CN1448510A(BEIJINGTRI-PRIMEGENETICENGINEERINGCO.,LTD.),15October2003(15.10.2003),claims1-3,anddescription,page2,paragraph3andsequencetableMay2015(13.05.2015),
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INTERNATIONAL
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(means)
ΓΊ
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b.(time)
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ΓΊΓΊ
2.□
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asfiled,asappropriate,
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ClaimsNos.:16
becausetheyrelatetosubjectmatternotrequiredtobesearchedbythisAuthority,PCTRule39.1(iv),forwhichaninternationalprovided
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namely:
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composition
onthebasisthatsaidclaimisreasonablyexpectedtobe\"ausageforthepreparation
2.□ClaimsNos.:
becausetheyrelatetopartsoftheinternationalthatnomeaningful
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thatdonotcomplywiththeprescribedrequirements
tosuchanextent
searchcanbecarriedout,specifically:
3.□ClaimsNos.:
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15October2003NoneNoneNone
21October201513May2015
FormPCT/ISA/210(patentfamilyannex)(July2009)
A.
主题的分类C12N
15/12
(2006.
01)i;C12N
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(2006.
01)i;A61K
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B.
检索领域
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C12NA61K
A61P
包含在检索领域中的除最低限度文献以外的检索文献
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数据库：CNABS,
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CNKI,DWPI,SIPOABS,
CNTXT,
WOTXT,
USTXT,
EPTXT,
ISI
WebofKnowledge,
google,
EMBL+Gen-human-,neutral
izer,
，中国专利生物序列检索系统；
fibroblast
growth
factor,
关键词：重组人碱性成纤维细胞生长因子，大肠杆菌，表达，稳定剂，甘
dry
eye,
stabi
lizer,
moisturizer,
eye
drops
氨酸，组氨酸，缓冲液，缓冲体系，增稠剂，中和剂，保湿剂，滴眼液，凝胶，干眼症，recombinant,
rh-bFGF,
e.coli,对序列SEQIDNO:
C
1-6的检索
相关文件类型*
X
CN1448510
引用文件，必要时，指明相关段落
(北京三元基因工程有限公司）2003年10月15日（2003-10-15)
权利要求1-3，说明书第2页第3段和序列表
A
相关的权利要求
1-3
XCN104984326
(珠海亿胜生物制药有限公司)2015年10月21日(2015
摘要，权利要求1-6，说明书第5-13段和实施例1-4
AA
-10-21)4-17
YCN1448510
(北京三元基因工程有限公司）2003年10月15日（2003-10-15)
权利要求1-3，说明书第2页第3段和序列表
(珠海亿胜生物制药有限公司)2015年5月130
摘要，权利要求1-2，说明书第3段
AA
(2015
-05-13)
4-17
Υ
CN1046066664-17
ACN104984326
(珠海亿胜生物制药有限公司)2015年10月21日(2015
摘要，权利要求1-6，说明书第5-13段和实施例1-4
-10-21)1-3
口
*\"A\"\"E\"\"
其余文件在C栏的续页中列出。
引用文件的具体类型：
认为不特别相关的表示了现有技术一般状态的文件在国际申请日的当天或之后公布的在先申请或专利
可能对优先权要求构成怀疑的文件，或为确定另一篇引用文件的公布日而引用的或者因其他特殊理由而引用的文件（如具体说明的）
涉及口头公开、使用、展览或其他方式公开的文件公布日先于国际申请日但迟于所要求的优先权日的文件
\"Y\"\"\"X\"
见同族专利附件。
在申请日或优先权日之后公布，与申请不相抵触，但为了理解发明之理论或原理的在后文件
特别相关的文件，单独考虑该文件，认定要求保护的发明不是新颖的或不具有创造性
特别相关的文件，当该文件与另一篇或者多篇该类文件结合并且这种结合对于本领域技术人员为显而易见时，要求保护的发明不具有创造性同族专利的文件
\"0\"\"？\"
\"&\"
国际检索实际完成的日期
2018年
ISA/CN的名称和邮寄地址
3月
8日
国际检索报告邮寄日期
2018年
3月
22日
受权官员
罗霄
电话号码
(2009年7月)
(86-10)
62089158
中华人民共和国国家知识产权局（ISA/CN)
中国北京市海淀区蓟门桥西土城路6号100088传真号
(86-10)
62019451
表PCT/ISA/210(第2页)
第I栏核苷酸和/或氨基酸序列（续第1页第
1.c
项)
1.关于国际申请中所公开的任何对要求保护的发明必要的核苷酸和/或氨基酸序列，国际检索是在下列基础上进行的：
a.
(提交提供）□
纸件形式电子形式
b.(提交时间）
含在申请提交时的国际申请中
□□
以电子形式与国际申请一起提交为检索之用随后提交本单位
2.□另外，在提交/提供了多个版本或副本的序列表的情况下，提供了关于随后提交的或附加的副本中的信息与申请时提交的申请中的信息相同或未超出申请时提交的申请中的信息范围
（如适用）的所需声明。
3.补充意见:
表PCT/ISA/210(第1页续页）（2009年7月）
第II栏某些权利要求被认为是不能检索的意见（续第1页第2项）
根据条约第17条(2)(a),对某些权利要求未做国际检索报告的理由如下：
权利要求：16
因为它们涉及不要求本单位进行检索的主题，即：[1]
1.
权利要求16涉及对有生命的人体或动物体的治疗方法，属于PCT实施细则第39.1(iv)规定的无须检索的情况。对其检索和书面意见是基于将其合理预期为\"一种用于制备治疗干眼症药物组合物的用途\"作出的。
2.□权利要求：
因为它们涉及国际申请中不符合规定的要求的部分，以致不能进行任何有意义的国际检索，具体地说：
权利要求：
因为它们是从属权利要求，并且没有按照细则6.4(a)第2句和第3句的要求撰写
表PCT/ISA/210(第1页续页）（2009年7月）
关于同族专利的信息
PCT/CN2017/089823
检索报告引用的专利文件
CNCNCN
公布日(年/月/日)
AAA
2003年2015年2015年
10月
15日
同族专利
无
公布日(年/月/日)
1448510104984326104606666
10月21日5月
13日
表PCT/ISA/210(同族专利附件）（2009年7月）
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