一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法[发明专利]

*CN103205368A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103205368 A(43)申请公布日 2013.07.17

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310004856.1(22)申请日 2013.01.08

(71)申请人浙江省致中和生物健康食品研究院

地址311607 浙江省杭州市建德市洋溪街道

高畈村(72)发明人俞建午 李小兵 朱增亮 钱淑芳(74)专利代理机构杭州杭诚专利事务所有限公

司 33109

代理人王江成(51)Int.Cl.

C12N 1/18(2006.01)C12N 11/10(2006.01)C12N 11/04(2006.01)C12R 1/865(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图1页权利要求书1页 说明书4页 附图1页

(54)发明名称

一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法(57)摘要

本发明涉及生物工程技术领域，提供了一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法。本发明步骤为：（1）从市售的生香酵母中筛选得到生香优良的酵母菌株；（2）将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒；（3）对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化，循环驯化多次，最后得到耐高温耐乙醇的生香酵母。本发明选用循环梯度驯化法，操作简单、方便，可以筛选出耐高温耐乙醇的酵母菌株，解决了芝兰香型白酒生产中生香酵母的耐高温、耐乙醇性能差的缺陷，提高了发酵能力。

CN 103205368 ACN 103205368 A

权 利 要 求 书

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1. 一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，其特征在于：所述的驯化方法步骤如下：（1）、以总酯含量和闻香为指标，同时兼顾酒精度，从市售的生香酵母中筛选得到生香优良的酵母菌株；

（2）、将步骤（1）筛选得到生香优良的酵母菌株接入麦芽汁培养基中培养至对数期，获得对数期生香酵母菌液，将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒，用无菌水将固定化凝胶颗粒水洗后获得固定化生香酵母；

（3）、对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化，具体设置参数为：循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-5%，最高浓度为10%-15%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-32 ℃，最高温度为40-45 ℃；每个梯度采用乙醇体积百分比浓度的梯度增幅1%-3%及采用温度梯度增幅0.5℃-3℃；循环驯化多次，最后得到耐高温耐乙醇的生香酵母。

2.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于：步骤（1）具体为：将市售的生香酵母纯化培养后在30℃下用麦芽汁培养基培养7天得发酵液，以国标GB/T 10345-2007为标准，闻香并测定发酵液酒精度、总酯，达标的酵母菌株即为生香优良的酵母菌株。

3.根据权利要求1或2所述的驯化方法，其特征在于：步骤（2）中凝胶球颗粒的具体制备方法为：采用1.0-3.0 g海藻酸钠加入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，加热溶解后冷却，取3-5 mL对数期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均匀，混合液通过注射器注入1-3%重量百分比浓度的氯化钙水溶液中，制备成凝胶球颗粒。

4.根据权利要求3所述的驯化方法，其特征在于：所述凝胶球颗粒的直径为2-3mm。5.根据权利要求1所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-3%，最高浓度为10%-12%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-30℃，最高温度为40-42℃。

6.根据权利要求5所述的驯化方法，其特征在于：循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度梯度具体为：2%、4%、6%、8%、10%、12%，循环梯度驯化的温度梯度具体为：30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃。

7.根据权利要求1或5或6所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中循环驯化次数为2-5次。

8.根据权利要求1或5或6所述的驯化方法，其特征在于：步骤（3）中每个梯度的驯化时间为24-72小时。

9.根据权利要求8所述的驯化方法，其特征在于：每个梯度的驯化时间为40-48小时。10.根据权利要求1或2或5或6所述的驯化方法，其特征在于：乙醇驯化培养基由乙醇与YPD液体培养基混合组成。

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说 明 书

一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方

法。

背景技术

[0002] 生香酵母又称为产酯酵母，能够以乙醇为碳源，既具备酒精发酵能力又具备醋酸发酵能力，能够产生以酯香为主的多种香味物质。其可以以糖、醛、有机酸、盐类为养料，在酯酶作用下合成酯类。芝兰香型白酒兼具酱香味和糊味，因而选育出生香功能强大的生香酵母，将有利于芝兰香型白酒产酯增香、除杂味、使酒体协调，改善芝兰香型白酒质量。[0003] 芝兰香型白酒生产采用高温堆积，中温和低温酵母菌细胞生长受到抑制；且随着发酵进行乙醇逐渐积累，当其浓度达到一定值时便会抑制酵母菌的细胞生长和代谢。因此选育优良的耐高温、耐乙醇生香酵母菌株，既能提高芝兰香型白酒生产产率，又能改善芝兰香白酒质量。

[0004] CN101831386A的发明公开了一种耐盐生香酵母筛选方法及其工艺，其方法是：采用15W的紫外灯30cm处照射菌悬液而诱变菌种，用透明圈法，初筛到比出发菌种优良的菌种，再通过放在生产曲房与生产成曲同步培养进行复筛，最后将酵母菌经多次驯化培养，平板分离，使筛选菌种纯化，得到优质耐盐生香酵母。但是该酵母并不能耐高温、耐乙醇，不适用于芝兰香型白酒生产。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，该方法操作简单、方便，可以筛选出耐高温耐乙醇的酵母菌株，适用于芝兰香型白酒生产。[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种耐高温耐乙醇生香酵母的驯化方法，所述的驯化方法步骤如下：（1）、以总酯含量和闻香为指标，同时兼顾酒精度，从市售的生香酵母中筛选得到生香优良的酵母菌株；

（2）、将步骤（1）筛选得到生香优良的酵母菌株接入麦芽汁培养基中培养至对数期，获得对数期生香酵母菌液，将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒，用无菌水将固定化凝胶颗粒水洗后获得固定化生香酵母；

（3）、对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化，具体设置参数为：循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-5%，最高浓度为10%-15%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-32 ℃，最高温度为40-45 ℃；每个梯度采用乙醇体积百分比浓度的梯度增幅1%-3%及采用温度梯度增幅0.5℃-3 ℃；循环驯化多次，最后得到耐高温耐乙醇的生香酵母。

[0007]

驯化是一种定向选育微生物的方法，其中的微生物由于逐步适应某种特定条件，

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说 明 书

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最后获得较高耐受力和代谢活性。本发明以市售的生香酵母为对象，通过开发合适的驯化方法，以获得适用于芝兰香型白酒生产的耐高温耐乙醇的生香酵母。[0008] 作为优选，步骤（1）具体为：将市售的生香酵母纯化培养后在30℃下用麦芽汁培养基培养7天得发酵液，以国标GB/T 10345-2007为标准，闻香并测定发酵液酒精度、总酯，达标的酵母菌株即为生香优良的酵母菌株。[0009] 作为优选，步骤（2）中凝胶球颗粒的具体制备方法为：采用1.0-3.0 g海藻酸钠加入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，加热溶解后冷却，取3-5 mL对数期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均匀，混合液通过注射器注入1-3%重量百分比浓度的氯化钙水溶液中，制备成凝胶球颗粒。[0010] 作为优选，所述凝胶球颗粒的直径为2-3mm。[0011] 作为优选，步骤（3）中循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度范围为：最低浓度为1%-3%，最高浓度为10%-12%；循环梯度驯化的温度范围为：最低温度为28-30℃，最高温度为40-42℃。[0012] 作为优选，循环梯度驯化的乙醇驯化培养基中乙醇体积百分比浓度梯度具体为：2%、4%、6%、8%、10%、12%，循环梯度驯化的温度梯度具体为：30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃。

[0013] 作为优选，步骤（3）中循环驯化次数为2-5次。[0014] 作为优选，步骤（3）中每个梯度的驯化时间为24-72小时。[0015] 作为优选，每个梯度的驯化时间为40-48小时。[0016] 作为优选，乙醇驯化培养基由乙醇与YPD液体培养基混合组成。本发明的有益效果是：

1、选用循环梯度驯化法，操作简单、方便，可以筛选出耐高温耐乙醇的酵母菌株，解决了芝兰香型白酒生产中生香酵母的耐高温、耐乙醇性能差的缺陷，提高了发酵能力，同时也为其它香型白酒相关研究提供借鉴意义。[0018] 2、本发明选用固定化酵母菌形式进行驯化，使得其可以在极端条件下进行反复使用，具有操作快速、简单。

[0017]

附图说明

[0019]

图1是本发明实施例1的循环梯度驯化流程示意图。

具体实施方式

[0020] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。[0021] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。[0022] 麦芽汁培养基、YPD固体培养基及YPD液体培养基均为现有常规培养基。[0023] 实施例1

（1）、生香酵母曲购自山东梁山良友生物工程有限公司，取2 g干曲置于装有100 mL无菌水并带玻璃珠的三角瓶中，200 r/min振荡30 min后进行梯度稀释，取l0-5、10-6、10-7 稀释度的样品200 μL均匀涂布于YPD固体培养基的平板上，每个样品平行涂布4块。待长

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说 明 书

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出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2~3 次，经镜检为纯种后分别转入YPD 固体培养基斜面，低温保存，备用。[0024] 取保存的纯种酵母菌株，30℃下用麦芽汁培养基培养7天得发酵液，以国标GB/T 10345-2007为标准，闻香并测定发酵液的酒精度、总酯，达标的酵母菌株即为生香优良的酵母菌株（若有5株以上的酵母菌株达标，则选取总酯含量最高的三株作为生香优良的酵母菌株）。

[0025] （2）、将步骤（1）筛选得到生香优良的酵母菌株接入麦芽汁培养基中培养至对数期，获得对数期生香酵母菌液，将对数期生香酵母菌液与海藻酸钠水溶液在室温无菌状态下混合均匀，再将混合液加入到氯化钙水溶液中制备成凝胶球颗粒，然后在2-4℃下固化4-5小时得固定化凝胶颗粒，用无菌水将固定化凝胶颗粒水洗后获得固定化生香酵母；

采用1.5 g海藻酸钠加入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，加热溶解后冷却，取4 mL对数期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均匀，混合液通过注射器注入2%重量百分比浓度的氯化钙水溶液中，制备成凝胶球颗粒然后放入4℃冰箱中固化4 h，用无菌水将固定化凝胶颗粒洗三次得固定化生香酵母。[0026] （3）、对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基（乙醇驯化培养基由乙醇与YPD液体培养基混合组成，以下乙醇的百分比均为体积百分比）中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化（如图1所示），具体步骤如下：

预培养：将固定化生香酵母置于YPD液体培养基中（即0%乙醇），30 ℃培养48小时，然后按以下步骤进行：

1、在无菌状态下，将预培养后固定化生香酵母转移到2%乙醇驯化培养基（即乙醇含量2%）中，30℃培养48小时：

2、将固定化生香酵母转移到2%乙醇驯化培养基中，32℃培养48小时；3、将固定化生香酵母转移到4%乙醇驯化培养基中，32℃培养48小时；4、将固定化生香酵母转移到4%乙醇驯化培养基中，34℃培养48小时；5、将固定化生香酵母转移到6%乙醇驯化培养基中，34℃培养48小时；6、将固定化生香酵母转移到6%乙醇驯化培养基中，36℃培养48小时；7、将固定化生香酵母转移到8%乙醇驯化培养基中，36℃培养48小时；8、将固定化生香酵母转移到8%乙醇驯化培养基中，38℃培养48小时；9、将固定化生香酵母转移到10%乙醇驯化培养基中，38℃培养48小时；10、将固定化生香酵母转移到10%乙醇驯化培养基中，40℃培养48小时；11、将固定化生香酵母转移到12%乙醇驯化培养基中，40℃培养48小时；12、将固定化生香酵母转移到12%乙醇驯化培养基中，42℃培养48小时；循环回到步骤1，依次反复培养3个循环，最后获得耐高温耐乙醇的生香酵母。[0027] 通过本发明的方法得到耐高温耐乙醇的生香酵母：耐温度范围为36℃-40℃，耐乙醇浓度范围为5%-9%；且总酯含量和闻香结果与驯化之前保持稳定。[0028] 实施例2

生香酵母曲购自山东梁山徐家制曲厂，本实施例与实施例1的不同之处在于对固定化生香酵母在乙醇驯化培养基中进行耐高温耐乙醇的循环梯度驯化参数：

预培养：将固定化生香酵母置于YPD液体培养基中（即0%乙醇），30 ℃培养42小时，然

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说 明 书

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后按以下步骤进行：

1、在无菌状态下，将预培养后固定化生香酵母转移到3%乙醇驯化培养基（即乙醇含量2%）中，30℃培养42小时：

2、将固定化生香酵母转移到3%乙醇驯化培养基中，33℃培养42小时；3、将固定化生香酵母转移到6%乙醇驯化培养基中，33℃培养42小时；4、将固定化生香酵母转移到6%乙醇驯化培养基中，36℃培养42小时；5、将固定化生香酵母转移到9%乙醇驯化培养基中，36℃培养42小时；6、将固定化生香酵母转移到9%乙醇驯化培养基中，39℃培养42小时；7、将固定化生香酵母转移到12%乙醇驯化培养基中，39℃培养42小时；8、将固定化生香酵母转移到12%乙醇驯化培养基中，42℃培养42小时；循环回到步骤1，依次反复培养5个循环，最后获得耐高温耐乙醇的生香酵母。[0029] 通过本发明的方法得到耐高温耐乙醇的生香酵母：耐温度范围为36℃-40℃，耐乙醇浓度范围为5%-9%；且总酯含量和闻香结果与驯化之前保持稳定。[0030] 实施例3

生香酵母曲购自济南久益生物工程有限公司，方法与实施例1相同。最终得到耐高温耐乙醇的生香酵母：耐温度范围为36℃-40℃，耐乙醇浓度范围为5%-9%；且总酯含量和闻香结果与驯化之前保持稳定。

[0031] 本发明权利要求所给出的范围均是可以实施的，其结果与实施例1-3类似，在此不作赘述。

[0032] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

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说 明 书 附 图

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图1

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